Inhibitors of AChE, BuChE and amyloid-beta-aggregation of pyridylenhydrazone-type

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Synthese und biologischen Testung von Anti-Alzheimer-Substanzen, die nicht nur auf einen Angriffspunkt der Krankheit abzielen, sondern an mehreren krankheitsauslösenden bzw. krankheitsfördernden Punkten inhibierend wirken können. Als Leitstruktur dienten bereits bekannte Acetylcholinesteraseinhibitoren der DUO-Reihe, welche sukzessive abgewandelt wurden, bis die entscheidenden Strukturmerkmale für eine Acetylcholinesterasehemmung herausgefiltert waren. Wichtig für die Interaktion mit der Acetylcholinesterase ist ein quartärer Stickstoff sowie aromatische Reste in seiner näheren Umgebung. Durch die Pyridylen-Hydrazone ist dies gewährleistet. Aufgrund dessen wurde eine Substanzbibliothek synthetisiert, die nun die Acetylcholinesterasehemmung mit einer Inhibition der Fibrillenbildung verbindet. Synthese: Aus 4-Chlorpyridin-Hydrochlorid wurde zuerst die freie Base freigesetzt und diese mit Hydrazin-Hydrochlorid zu 4 Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid umgesetzt. Dieses reagierte im nächsten Schritt mit dem entsprechenden Aldehyd in einer SN2-Reaktion zu den Zwischenstufen 2-14, die nun einen variablen Rest an der Hydrazinylgruppe tragen. Im letzten Schritt erfolgte die Quarternisierung mit Hilfe des entsprechenden Alkylbromids, wodurch am Pyridylrest derivatisiert wurde und schlussendlich die Verbindungen 2A-14O erhalten wurden. Dieser letzte Schritt, welcher anfangs durch klassische Erhitzung zum Rückfluss in DMF durchgeführt wurde, konnte zuerst durch die Durchführung im Bombenrohr zeitlich verkürzt werden und schließlich in der Mikrowelle optimiert werden, was zu einer Reduktion der Reaktionszeit von 500 h auf 3 h führte. Die Testung der Substanzen bezüglich ihrer AChE- und BuChE-Hemmung erfolgte mittels Ellman’s Test. Für die Testung der hemmenden Wirkung bezüglich der Fibrillen wurde zuerst das Testsystem mit Aβ (1-42) aufgebaut und anschließend auf ein verkürztes, elf Aminosäuren langes Peptid (HHQKLVFFAED), das mit Hilfe eine Peptidsynthesizers hergestellt wurde, übertragen. Nimmt man nun wieder Bezug auf den „Multi-target-Ansatz“, so lassen sich folgende Ergebnisse festhalten: Die Verbindung eines elektronen-ziehenden Substituenten am Phenylring an der Hydrazonseite mit einem Propylrest zwischen dem Phenylring und dem Pyridinrest ist vorteilhaft für die Kombination der Hemmung der Acetylcholinesterase und der Inhibiton der Aβ-Fibrillen (vgl. 13C). Während viele Substanzen selektiv gegenüber der Acetylcholinesterase sind, gibt es nur wenige, die selektiv die Butyrylcholinesterase hemmen. Eine Hemmung aller drei Angriffspunkte im niedrigen mikromolaren Bereich zeigten nur wenige Substanzen, und zwar die Verbindung mit jeweils einem Naphthylrest sowohl an der Hydrazon- als auch der Pyridin-Seite (14K: IC50 (AChE) = 1.12 µM; IC50 (BuChE) = 2.32 µM; IC50 (Fibrillen) = 2.5 µM). Zusätzlich wurden die Substanzen auf eine mögliche ROS-Hemmung von Kooperationspartnern getestet. Sie zeigten einen kleinen aber signifikanten Beitrag zur Reduzierung der ROS. Um erfolgreiche Wirkstoffe gegen die Alzheimer-Krankheit zu entwickeln, ist deren Blut-Hirn-Schrankengängigkeit von entscheidender Bedeutung. Deshalb wurde von den Substanzen mittels HPLC der logP-Wert bestimmt. Die logP-Werte der Substanzen liegen in einem Bereich von 3.2 bis 4.4. Aufgrund dieser Ergebnisse und der berechneten pKS-Werte, welche im Bereich von 8.3 bis 10.2 liegen, kann davon ausgegangen werden, dass die Substanzen auf Grund der „sink“-Bedingungen die Blut-Hirn-Schranke überqueren können. Um eine definitive Aussage zur Blut-Hirn-Schrankengängigkeit treffen zu können, wurde ein Transwell-System mit cerebralen Endothelzellen entwickelt, die die Blut-Hirn-Schranke simulieren. Die Endothelzellen bilden hierbei eine dichte Monoschicht auf dem Filter aus, wobei die Substanzen nicht zwischen den Zellen hindurch diffundieren können, sondern den Weg durch die Zelle nehmen müssen. Die Messungen ergaben, dass die Substanzen zu ca. 90 % durch die Zellen diffundieren können und somit erfolgreich die Blut-Hirn-Schranke überqueren können.The thesis is dealing with the synthesis and biological evaluation of substances combating Alzheimer’s disease by using a multi-target approach. Starting point was the lead structure of the known acetylcholinesterase inhibitors of the DUO-series, which was successively modified to filter the crucial structural characteristics of the inhibition of acetylcholinesterase. Important for the interaction with acetylcholinesterase is a quaternary nitrogen as well as an aromatic moiety nearby. This is combined in the pyridylene-hydrazones. Therefore a library of substances has been synthesized and evaluated for the inhibition of acetylcholinesterase and fibril formation. Synthesis: The free base of 4-chloropyridine-hydrochloride was produced and reacted with hydrazine-hydrochloride to give 4 hydrazinylpyridine-hydrochloride. Next, a corresponding aldehyde was added and the intermediates 2-14 including a variable moiety on the side of the hydrazinyl-group, were formed by a SN2-reaction. Finally the quaternization reaction with the corresponding alkylbromide was performed in order to introduce the residues at the side of the pyridyl moiety to achieve the final compounds 2A-14O. This step was carried out by classical heating to reflux in DMF, but could be improved by carrying out the reaction in a pressure vessel and even better in the microwave; here the reaction time could be reduced from 500 h to 3 h. The inhibitory activity of the compounds towards AChE and BuChE were performed with Ellman’s test. In order to determine the inhibition of fibril formation, the Thioflavin T assay was first established with Aβ (1-42) and afterwards transferred to a shortened peptide containing only eleven amino acids (HHQKLVFFAED). This peptide was synthesized with a peptide synthesizer. In summary, combining an electron-withdrawing substituent at the phenyl ring on the site of the hydrazon with a propylene spacer between the phenyl ring an the pyridyl rest is of advantage when both targets – acetylcholinesterase and Aβ fibril formation – should be equally inhibited (see 13C). While many substances are selective towards acetylcholinesterase, only a few inhibit the butyrylcholinesterase selectively. An inhibition of all of the three targets in a low micromolar range of concentration could only be revealed for few compounds, e. g. for compound 14K with naphthyl-substitution on both sides: IC50 (AChE) = 1.12 µM; IC50 (BuChE) = 2.32 µM; IC50 (fibrils) = 2.5 µM). Additionally the substances were tested on a possible ROS-inhibition, however, they showed only little, but significant influence on a reduced production of ROS. In order to develop successfully new compounds against Alzheimer’s disease, their blood-brain-penetration is very important. For this reason the logP-value of the substances has been determined by a HPLC method. The logP-values range from 3.2 to 4.4. Due to these results and the calculated pKA-values, which ranged between 8.3 and 10.2, it can be assumed that the substances are able to cross the blood-brain-barrier because of sink-conditions. In order to verify this statement, a transwell-assay with cerebral endothelial cell monolayer has been developed to simulate the blood-brain-barrier. The measurements of some representative compounds revealed a diffusion rate through the cells of about 90 %, indicating the blood-brain-penetration of the compounds