Gametogenesis of the human malaria pathogen Plasmodium falciparum - the characterization of involved proteases and a description and functional analysis of gamete intercellular filaments

Malaria stellt mit einer Mortalität von über einer Million Menschen pro Jahr die bedeutsamste Tropenkrankheit für den Menschen dar. Wachsende Resistenzen der Malariaerreger gegenüber den verfügbaren Medikamenten erhöhen mehr denn je den Druck, neue Therapiemöglichkeiten sowie einen Impfstoff gegen diese Krankheit zu entwickeln. Eine Unterbrechung des sexuellen Fortpflanzungszyklus im Laufe der Transmission von Mensch zu Stechmücke würde zu einem Verbreitungsstopp des Erregers führen. Sowohl die Identifizierung von molekularen Wechselwirkungen als auch die Erforschung von an Fertilisationsereignissen beteiligten Prozessen sind wichtige Schritte, um die Sexualphase des Erregers aufzuklären und neue Angriffspunkte für Medikamente oder Vakzine zu entwickeln. Dem Genom von P. falciparum konnten 92 putative Proteasen zugeordnet werden, von denen nur ein geringer Bruchteil charakterisiert worden ist. Unter Anwendung von Protease-Inhibitoren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Exflagellation der männlichen Gameten die Beteiligung von Proteasen verschiedener Kategorien benötigt. Die Ergebnisse belegten, dass die Aktivität von zwei oder mehr Serinproteasen, von Falcipain-ähnlichen Cysteinproteasen, von nicht-Thermolysin-ähnlichen Zink-Metalloproteasen und von Aspartatproteasen für den erfolgreichen Abschluss der männlichen Gametogenese eine wichtige Voraussetzung ist. Die Lokalisation des Cysteinproteasen- und Falcipain-hemmenden Inhibitors bADA konnte erstmals im Zytosol von Sexualstadien nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurden zusätzlich die Proteasen Calpain, DPAP2, GPI8, Metacaspase 2, Plasmepsin 6 und PfSub3 näher untersucht. RT-PCR-Analysen konnten die Transkription der sechs ausgesuchten Proteasen in gemischten asexuellen Parasiten sowie zum Großteil in Gametozyten, Gameten und Zygoten belegen. Die Transformation von asexuellen Parasiten mit entsprechenden knockout-Konstrukten deckte für Metacaspase 2 und PfSub3 auf, dass sie im asexuellen Vermehrungszyklus nicht essentiell und die entsprechenden Genloci für Rekombinationsereignisse zugänglich sind. Die Ergebnisse der übrigen Transformationen deuteten darauf hin, dass Calpain essentiell im asexuellen Vermehrungszyklus und dass der Genlocus von Plasmepsin 6 für Rekombinationsereignisse unzugänglich ist. Proteinexpressionsstudien anhand von Western-Blot-Analysen und Immunfluoreszenzstudien für PfSub3 konnten Hinweise darauf liefern, dass diese Serinprotease in asexuellen Parasiten, nicht-aktivierten sowie aktivierten Sexualstadien exprimiert wird. Aufgrund der in dieser Arbeit generierten Ergebnisse konnten im Laufe der Gametogenese auftretende Gametenfilamente morphologisch beschrieben sowie Hinweise auf ihre mögliche Funktion erlangt werden. Durch die Anwendung von Immunfluoreszenzstudien, rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen sowie die Analyse lebender Gameten konnte gezeigt werden, dass die bis zu 180 µm langen Filamente am Ende geschlossen sind und einen Durchmesser von ca. 200 nm aufweisen. Die tubulären Zellausläufer konnten weiterhin als verzweigte sowie nicht-verzweigte Ausläufer der parasitären Plasmamembran dargestellt werden, die mit Zytoplasma gefüllt sind. Es konnte belegt werden, dass die Aktin-assoziierten Filamente in periodischen Abständen von beulenartigen Auswölbungen unterbrochen werden und dass sie in rasterelektronenmikroskopischen Analysen ein perlschnurartiges Erscheinungsbild aufweisen. Weiterhin wurde dokumentiert, dass die Zellausläufer mit typischen sexualstadienspezifischen Proteinen wie Pfs25, Pfs230, Pfs48/45 und PfCCp4 assoziiert vorliegen, wobei das Fehlen einzelner dieser Proteine jedoch nicht das Ausbilden der Gametenfilamente verhinderte. Als typisches Charakteristikum der Filamente konnte ihre Eigenschaft beschrieben werden, mehrere Makrogameten und zum Teil Gametozyten in einem Zellkluster miteinander netzartig zu verbinden, wobei bis zu neun Filamente von einem Makrogameten ausgehend beobachtet werden konnten. Die Gametenfilamente zeigten ebenfalls die Fähigkeit, an umliegende nicht-infizierte Erythrozyten sowie mit asexuellen Parasiten infizierte Erythrozyten zu adhärieren. Die Filamente waren bereits fünf Minuten nach der Aktivierung der Gametozyten und im Laufe der Gametogenese bei 33 bis 73 % der Zellen nachweisbar. Die Gametenfilamente blieben bis zu 12 Stunden nach Aktivierung der Gametozyten mit der Zelloberfläche verbunden. Der aktive Einzug eines Zellfilaments sowie die Bildung der Gametenfilamente im Mitteldarm der Stechmücke konnte ebenfalls demonstriert werden. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse lieferten unter anderem den Grundbaustein einer formulierten Funktionshypothese für diese Gametenfilamente. Es wird angenommen, dass die Filamente aufgrund ihrer adhäsiven Eigenschaften im Laufe der Befruchtung von Plasmodium im Mitteldarm der Stechmücke auftreten. Möglicherweise bedienen sich vitale Gameten dieser Strukturen, um andere Sexualstadien zu finden und sie zu verbinden.Malaria remains the deadliest among the tropical diseases with a death toll rate of more than one million people annually. Increasing resistance of the causative organism Plasmodium spec. against available drugs heightens the need for the development of new antimalarial drugs and a vaccine. The sexual reproduction phase of this pathogen has garnered increasing attention because of the potential to prevent the transmission of the parasite from human to mosquito by blocking fertilization and following essential processes in the vertebrate host. Therefore, the identification of molecular interactions during fertilization processes is essential to elucidate the sexual replication phase in order to develop new transmission blocking strategies. The genome of P. falciparum encodes for 92 putative proteases among them only few are partly characterized, although they are considered as excellent drug targets. The data herein defines the involvement of proteases belonging to various protease classes in the exflagellation of male gametes in P. falciparum. It was shown that this essential process of male gametogenesis can be blocked by use of different protease inhibitors. The data suggests an involvement of two or more serine proteases, falcipain-like cysteine proteases, non-thermolysin-like zinc metalloproteases and aspartic proteases in microgametocyte exflagellation. Furthermore, the described data defined the localization of the cysteine protease and falcipain-blocking inhibitor bADA. This inhibitor was shown to be localized in the cytosol of trophozoites, schizonts, gametocytes at all stages of maturity and macrogametes. Additionally, the present thesis achieved first evidence about six specifically selected and largely uncharacterized proteases calpain, DPAP2, GPI8, metacaspase 2, plasmepsin 6 and PfSub3. RT-PCR-Analyses were conducted to demonstrate the existence of transcript and consequently genetically active gene loci for mixed asexual parasites and for most of the gametocyte, gamete and zygote stages. The transformation of asexual parasites with metacaspase-2- and PfSub3-knockout-constructs led to the conclusion that these proteases are non-essential during the asexual replication cycle and their gene loci are accessible to homologous recombination. Additional transformation experiments indicated both that calpain is indispensable in the asexual replication cycle and that the gene locus for Plasmepsin 6 might be inaccessible for homologous recombination. The protein expression analysis for PfSub3 was carried out by using western blot and immunofluorescence assays. The analysis suggests that this serine protease is expressed in asexual parasites as well as in non-activated and activated gametocytes. Based on the data described herein, both the morphologic description of newly discovered filaments of gametes emerging during gametogenesis and the assignment of their putative function was possible. Using immunofluorescence analysis, scanning electron microscopy and live imaging analysis of gametes it was shown that these tubular filaments are about 200 nm in diameter and exhibit a length of up to 180 µm. Furthermore, it was demonstrated that they are close-ended, actin-associated and cytoplasm-containing cell extensions of the parasite’s plasma membrane with a branched or straight appearance. The surface of filaments was associated with bulge-like structures and appeared in scanning electron microscopy partly as a beaded structure. Additionally, it was demonstrated that the sexual stage surface proteins Pfs25, Pfs230, Pfs48/45 and PfCCp4 are connected with these cell extensions, whereby the lack of single proteins did not result in a complete blockade of filament formation. The most typical feature of the filaments was described: to connect several macrogametes and even gametocytes within a cell cluster. It was defined that up to nine filaments emerged from the surface of macrogametes, which were able to adhere to non-infected erythrocytes as well as to parasite-infected erythrocytes. Analysis of their formation revealed that the filaments are formed within five minutes after gametocyte activation and are able to persist on the surface of gametes for a time period of up to 12 hours. During gametogenesis, 33 to more than 70 % of macrogametes exhibited the described filaments. It was possible to demonstrate the active retraction of a filament formed by a macrogamete as well as the generation of a filament in the mosquito midgut. Due to these findings a putative function was assigned. Thus, it can be suggested that the filaments likely form during gametogenesis in the mosquito midgut due to their adhesive properties in order to locate and collect other sexual stages. It might be possible that the filaments are used as a tool of vital gametes to enhance fertilization in the vertebrate host