Konditionale Überexpression der neuronalen NO-Synthase wirkt kardioprotektiv bei Ischämie-Reperfusion

Zusammenfassung: Wie früher schon gezeigt, wird der L-Typ Ca2+-Kanal durch eine induzierbare, myokardspezifische Überexpression der neuronalen Stickstoffmonoxidsynthase (nNOS) inhibiert. Gleichzeitig bewirkt diese Überexpression eine verminderte kardiale Kontraktilität1 (Burkard N. et al. (2007). Circ Res 100, 32-44). nNOS interagiert mit vielen verschiedenen Kompartimenten und Kanälen innerhalb der Zelle. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass eine nNOS Überexpression nach Ischämie-Reperfusion kardioprotektiv wirkt. Dieses wird durch eine Inhibition der Mitochondrienfunktion und durch eine Verminderung der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) ermöglicht. In einer früheren Arbeit wurde der Effekt der induzierbaren und myokardspezifischen Überexpression von nNOS unter physiologischen Bedingungen am transgenen Tiermodell untersucht. Diese Arbeit beschäftigt sich nun mit der Überexpression von nNOS unter pathophysiologischen (Ischämie-Reperfusion) Bedingungen. Ein Ischämie-Reperfusions-Schaden bewirkt bei Wildtyp-Mäusen, sowie bei transgener nNOS Überexpression eine Anreicherung von nNOS in den Mitochondrien. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Mausmyokard haben gezeigt, dass bei Überexpression nNOS zusätzlich in den Mitochondrien lokalisiert ist. Diese Translokation von nNOS in die Mitochondrien ist abhängig von HSP90. Ischämie- Reperfusionsexperimente an isolierten Mäuseherzen zeigten einen kardioprotektiven Effekt der nNOS Überexpression (30min post ischemia, LVDP 27.0±2.5mmHg vs. 45.2±1.9mmHg, n=12, p<0.05). Dieser positive Effekt konnte bei der Bestimmung der Infarktgröße bestätigt werden. nNOS überexprimierende Mäuse hatten eine kleinere Infarktgröße nach Ischämie-Reperfusion (36.6±8.4 relative % vs. 61.1±2.9 relative %, n=8, p<0.05). Die Überexpression von nNOS bewirkte ebenfalls einen signifikanten Anstieg des mitochondrialen Nitrit-Levels, begleitet von einer Verminderung der Cytochrom C Oxidase Aktivität (72.0±8.9units/ml in nNOS overexpressing mice vs. 113.2±17.1units/ml in non-induced mice, n=12, p<0.01), was zu einer Hemmung der Mitochondrienfunktion führt. Dementsprechend war der Sauerstoffverbrauch (gemessen an isolierten Herzmuskelstreifen) schon unter basalen Bedingungen beinNOS Überexpression vermindert (0.016±0.0015 vs. 0.024±0.006ml[O2] x mm-3 x min-1, n=13, p<0.05). Außerdem war die ROS Konzentration in Herzen von nNOS überexprimierenden Mäusen signifikant vermindert (6.14±0.685 vs. 14.53±1.7μM, n=8, p<0.01). Die Zugabe von verschiedenen Inhibitoren, Western Blot- und Aktivitätsuntersuchungen zeigten schließlich, dass diese niedrigere ROS Konzentration durch eine verminderte Xanthin Oxidoreduktase Aktivität hervorgerufen wurde. Zusammenfassend hat diese Arbeit gezeigt, dass eine induzierbare und myokardspezifische Überexpression von nNOS unter pathophysiologischen Bedingungen (Ischämie-Reperfusion) kardioprotektiv wirkt. Zusätzlich zu der Verminderung des myokardialen Ca2+-Überschusses nach Reperfusion könnte dieser protektive Effekt durch eine Hemmung der Mitochondrienfunktion bedingt sein, schließlich wird der Sauerstoffverbrauch schon unter basalen Bedingungen reduziertSummary: I previously demonstrated that conditional overexpression of the neuronal nitric oxide synthase (nNOS) inhibited L-type Ca2+-channels and decreased myocardial contractility1 (Burkard N. et al. (2007). Circ Res 100, 32-44). However, nNOS has multiple targets within the cardiac myocyte and it is possible that interesting biological functions of this protein remain to be elucidated. In this study, I showed that nNOS overexpression has a cardioprotective effect after ischemia-reperfusion injury by inhibiting mitochondrial function and reducing the generation of reactive oxygen species (ROS). The effect of conditional nNOS overexpression in cardiac myocytes in ischemiareperfusion injury was assessed. Ischemia-reperfusion injury in WT mice resulted in nNOS accumulation in the mitochondria. Similary, transgenic nNOS overexpression caused nNOS abundance in mitochondria. Electron microscopy of mouse myocardium from nNOS overexpressing mice showed that after induction of its expression, nNOS is additionally localised in mitochondria. nNOS translocation into mitochondria was dependent on HSP90. Ischemia-reperfusion experiments in isolated hearts showed a cardioprotective effect of nNOS overexpression (30min post-ischemia, LVDP 27.0±2.5mmHg in non-induced animals vs. 45.2±1.9mmHg in nNOS overexpressing mice, n=12, p<0.05). Consistently with this finding, in vivo the infarct size within the area at risk was significantly decreased in nNOS overexpressing mice compared to non-induced animals (36.6±8.4 relative % vs. 61.1±2.9 relative %, n=12, p<0.05). nNOS overexpression also caused a significant increase in mitochondrial nitrite levels accompanied by a decrease of cytochrome c oxidase activity (72.0±8.9units/ml in nNOS overexpressing mice vs. 113.2±17.1units/ml in non-induced mice, n=12, p<0.01) resulting in an inhibition of mitochondrial function. Accordingly, O2-consumption (MVO2) in isolated heart muscle stripes was decreased in nNOS overexpressing mice, already under resting conditions (0.016±0.0015 vs. 0.024±0.006ml[O2] x mm-3 x min-1, n=13, p<0.05). Additionally, this study showed that the ROS concentration was significantlydecreased in hearts of nNOS overexpressing mice compared to non-induced animals (6.14±0.685 vs. 14.53±1.7μM, n=8, p