Morphologic and functional investigations of the biofilm formation by the human pathogen Neisseria meningitidis

1. Zusammenfassung Neisseria meningitidis ist weltweit ein bedeutender Erreger invasiver Infektionen bei Kindern und Heranwachsenden. Der in vielen Ländern niedrigen Inzidenz stehen hohe Raten asymptomatischer Kolonisation des menschlichen Nasopharynx mit Meningokokken gegenüber. Während die Pathogenese durch Meningokokken ausführlich untersucht ist, wurde dem Trägertum von Meningokokken bisher wenig Aufmerksamkeit geschenkt, nicht zuletzt auch wegen des Fehlens eines geeigneten Tiermodells. Kürzlich publizierte Daten lassen die asymptomatische Persistenz von Meningokokken in einem Biofilm-ähnlichen Stadium auf und innerhalb des Tonsillengewebes vermuten. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Etablierung eines Biofilmmodells für Meningokokken als ein Modell für asymptomatisches Trägertum. Es wurde zudem die Biofilmbildung von Meningokokken unterschiedlichster klonaler Linien mit dem Ziel untersucht, auf molekularer Ebene die Biofilmbildung bei Meningokokken zu verstehen. In statischen Biofilmtests konnte gezeigt werden, dass Biofilmbildung eine ubiquitäre Eigenschaft von Meningokokken ist, solange diese keine Kapsel exprimieren. Hierbei war es unerheblich, ob Trägerisolate oder Isolate aus invasiven Meningokokkenerkrankungen untersucht wurden. Durch die Konstruktion fluoreszierender Meningokokkenstämme und die Etablierung eines Minimalmediums konnte für Meningokokken ein standardisiertes Biofilmmodell unter Flussbedingungen erstellt werden. Das Flussmodell für Meningokokkenbiofilme erwies sich als äußerst robust und reproduzierbar. Es wurde deutlich, dass Meningokokken Biofilme unterschiedlicher Struktur ausbildeten, die teilweise über 120 Stunden in vitalem Zustand gehalten werden konnten. Die Mehrzahl der Stämme bildete heterogene Biofilme mit distinkten Mikrokolonien aus, während andere Stämme homogene Biofilme ohne Mikrokolonien ausbildeten. Diese strukturellen Unterschiede hatten keinen Effekt auf die Antibiotika-Empfindlichkeit der Biofilme. Es konnte gezeigt werden, dass Meningokokkenbiofilme durch Ciprofloxacin und Rifampicin, nicht aber durch Penicillin im Wachstumsmedium abgetötet werden konnten. Diese Ergebnisse passen zu in vivo-Befunden, die zeigen, dass Ciprofloxacin und Rifampicin im Gegensatz zu Penicillin sehr zuverlässig das Trägertum von Meningokokken eradizieren können. Durch die Untersuchung der Biofilmbildung von PilX- und PilE-Mutanten konnte die Bedeutung der Twitching Motility für die Mikrokoloniebildung im Meningokokkenbiofilm aufgezeigt werden. Ausgeprägte Motilität führte zu Mikrokoloniebildung, während weitgehend unbewegliche Stämme flache unstrukturierte Biofilme bildeten. In der vorliegenden Arbeit konnte der Verlust der Mikrokoloniebildung bei der PilX-Mutante durch Reduktion der Piliierung, die zu verminderter Motilität führte, erklärt werden. Autoaggregation der Zellen spielte für die Mikrokoloniebildung keine Rolle, was im Widerspruch zur kürzlich publizierten Rolle von PilX steht. Initiale Schritte der Biofilmbildung bei Meningokokken könnten von extrazellulärer DNA (exDNA) abhängen, da die Zugabe von DNase zur Vorkultur die Biofilmbildung verhinderte, jedoch bestehende reife Biofilme nicht auflöste. Die Funktion, der Mechanismus der Freisetzung, sowie die Menge und Verteilung dieser exDNA in Meningokokkenbiofilmen wird Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein.2. Summary Neisseria meningitidis worldwide contributes significantly to childhood and adolescent morbidity and mortality. The low incidence of disease in many countries is in opposition to the high rates of asymptomatic meningococcal colonization of the human nasopharynx. While meningococcal pathogenesis has been studied extensively, only little attention has been paid to meningococcal carriage so far, not least because of the lack of an appropriate animal model. Recently published data lead to the assumption that meningococci persist asymptomatically on top of and within tonsillar tissue in a biofilm-like stage. Therefore, the aim of the present study was the establishment of a biofilm model for meningococci as a model for asymptomatic carriage. Biofilm formation of different clonal lineages was investigated to better understand meningococcal biofilm formation on a molecular level. First experiments using static biofilm assays revealed that biofilm formation is a ubiquitous property of meningococci, as long as no polysaccharide capsule is expressed. In this regard it was irrelevant whether carriage isolates or isolates from invasive meningococcal disease were investigated. By constructing fluorescent meningococcal strains and by establishing a suitable minimal growth medium, a meningococcal biofilm model under standardized flow conditions could be established. The flow model for meningococcal biofilms turned out to be very robust and reproducible. It became apparent that meningococci formed biofilms with different structures, which could partly be maintained in a vital state for more than 120 hours. The majority of strains formed heterogeneous biofilms with distinct microcolonies, while other strains formed homogeneous biofilms without microcolonies. These structural differences had no impact on the antibiotic susceptibility of the biofilms. All meningococcal biofilms were killed by ciprofloxacin and rifampin, but not by penicillin in the growth medium. These results fit to in vivo-findings, where ciprofloxacin and rifampin in contrast to penicillin very reliably eradicated meningococcal carriage. By investigating the biofilm formation of PilX and PilE mutants the impact of twitching motility for microcolony formation could be highlighted. Pronounced motility led to microcolony formation, while almost non-motile strains formed flat unstructured biofilms. In the present work the loss of microcolony formation by reduced motility in the PilX mutant could be explained by a reduction of the piliation status. Autoaggregation had no impact on microcolony formation, which is in conflict to the recently published role of PilX. Early steps of meningococcal biofilm formation might depend on extracellular DNA (exDNA) as a matrix substance, since the addition of DNase prevented biofilm formation, but did not dissolve pre-existing mature biofilms. The function of this exDNA, the mechanism of release, as well as the amount and distribution on meningococcal biofilms will be the subject to further investigations