Investigations on biofilm formation and quorum sensing in Staphylococcus epidermidis

Das Gram-positive, Koagulase-negative Bakterium Staphylococcus epidermidis war viele Jahrzehnte als harmloser Kommensale der menschlichen Haut und der Schleimhäute bekannt. Jedoch hat sich S. epidermidis in den letzten zwanzig Jahren zu einem Haupterreger von Nosokomialinfektionen entwickelt. Dabei unterscheidet sich S. epidermidis im Vergleich zu anderen Erregern durch ein sehr begrenztes Spektrum an Pathogenitätsfaktoren, aber auch durch seine Fähigkeit, Biofilme auf künstlichen Oberflächen wie Kathetern und Implantaten formen zu können. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit zwei Hauptaspekten, die in der Pathogenität von S. epidermidis eine wichtige Rolle spielen: (i) dem Quorum-sensing System Agr (accessory gene regulator) und (ii) dem zeitlichen Prozess des Aufbaus, sowie der Regulation der Biofilmbildung von S. epidermidis. Das Quorum-sensing System Agr ist Teil eines komplexen regulatorischen Netzwerks. In der vorliegenden Arbeit wird durch Proteom- und Transkriptomanalysen gezeigt, dass das Agr-System in S._epidermidis den Hauptregulator für die Sekretion von extrazellulären Proteinen darstellt und darüber hinaus einen großen Einfluss auf die Regulation des Zentralmetabolismus und der Biosynthese von Aminosäuren hat. Mittels Mikroarray-Analyse konnte eine wichtige Verknüpfung des Agr-Systems mit dem pleiotrophen Repressor CodY identifiziert werden, der viele stationäre-Phase Gene im S._epidermidis Wildtyp reprimiert, jedoch nicht in der getesteten agr Mutante. Dieses führt zu einem stark veränderten Phänotyp der S. epidermidis agr Mutante, in Hinblick auf Wachstumskapazität, der Biofilmbildung, der Invasivität und dem Langzeitüberleben. Interessanterweise ergaben wissenschaftliche Studien, dass ca. 17 % der klinischen Isolate natürlich vorkommende agr Mutanten sind. Dieses könnte ein Hinweis darauf sein, dass S. epidermidis agr Mutanten aufgrund ihres stark veränderten Phänotyps und ihrer veränderten biochemischen Bedürfnisse und Kapazität in der Lage sind, andere ökologische Nischen im menschlichen Wirt zu besiedeln. Der zweite Teil dieser Arbeit hat die Biofilmbildung von S. epidermidis zum Thema. Durch die Etablierung eines standardisierten Modells der Biofilmbildung, war es möglich, über die Einführung einer Biofilm-Adhäsion-Ratio die Biofilmbildung als zeitlichen dynamischen Prozess darzustellen und verschiedenste Bedingungen und Stämme miteinander zu vergleichen. Dabei zeigte sich, dass die Biofilmbildung in S._epidermidis ein klar zeitlich strukturierter Prozess ist, der von Umweltfaktoren und der Nährstoffsituation abhängig ist, und dass verschiedene Stämme sehr unterschiedlich auf Veränderungen in ihrer Umwelt reagieren. Die zeitliche Analyse der Biofilmbildung mittels konfokaler Lasermikroskopie ergab, dass viele der Bakterien im Biofilm sterben. Dieses macht den Biofilm wesentlich anfälliger für Strömungsscherkräfte, die dann ganze Bakterienverbände ablösen und zu neuen Infektionsherden schwemmen könnten. Somit ermöglicht der Tod einer einzelnen Zelle unter Umständen ein besseres klonales Überleben. Die Mikroarray-Analysen der Genexpression im Biofilm zeigten, dass dieser einen physiologisch klar definierten Prozess durchläuft, der zu einer sehr stark verminderten metabolischen Aktivität und einer erhöhten Antibiotika-Resistenz führt. Darüber hinaus zeigen Bakterien im Biofilm einen weniger aggressiven Charakter, wie die Expression von Proteasen oder anderer Pathogenitätsfaktoren, welches S. epidermidis dabei hilft, dem Immunsystem des Wirts zu entgehen. Diese neuen Ergebnisse zur Regulation der Genexpression im Biofilm und zur Rolle des Quorum-sensing Systems Agr in S. epidermidis tragen wesentlich zum Verständnis der Pathogenität und der Physiologie dieses wichtigen nosokomialen Erregers bei. Sie bilden eine wichtige theroretische Grundlage für weiterführende Studien, mit dem Ziel in Zukunft neue Therapie- und Präventionsansätze gegen S. epidermidis-Infektionen zu entwickeln.The gram-positve, coagulase-negative bacterium Staphylococcus epidermidis was regarded as a harmless commensal of the human skin and mucosa. However, in the last two decades S. epidermidis has emerged as one of the major causes of nosocomial infections. In contrast to other infectious bacteria, S. epidermidis possesses only a limited number of pathogenicity factors, but forms a thick biofilm on artificial devices such as catheters and implants. This thesis deals with two main aspects of the pathogenicity of S. epidermidis: (i) the Quorum-sensing system Agr (accessory gene regulator) and (ii) the aspects of time dependency of biofilm formation and its regulatory mechanism. The Quorum-sensing system Agr is part of a complex network in Staphylococci. This work demonstrates that the Agr-System is the main regulator for the extracellular proteome. Moreover, it affects directly and indirectly the central metabolism and the biosynthesis of amino acids in S. epidermidis. By employing microarray and proteome analyses the pleiotrophic repressor CodY was identified as an important player which interacts with the Agr-system and influences staphylococcal metabolism. CodY is responsible for the repression of late stationary phase genes. Proteome and transcriptome analyses along the growth curve revealed that this effect occurs only in the S. epidermidis agr wild type, while the S. epidermidis agr mutant expresses late stationary phase genes right from the beginning of the exponential growth stage. This leads to a strongly altered phenotype of the S. epidermidis agr mutant concerning growth capacities, biofilm formation, invasion into host cells and long term survival. Interestingly, another study has shown recently that about 17 % of all clinical isolates are naturally occurring S. epidermidis agr mutants. This supports the hypothesis that S. epidermidis agr mutants are capable of clonizing alternative ecological niches by their strong altered biochemical and physiological properties. The main focus in the second part of this thesis aims at biofilm formation of S. epidermidis. In order to compare different conditions and strains for their biofilm capacity, a standardized protocol was established and a simple mathematical model was introduced. These investigations underlined that biofilm formation in S. epidermidis is a chronologically synchronized, but dynamic process which depends on environmental conditions and nutrition supply. In addition, different strains display variations in responsing to altered environmental conditions. Interestingly, S. epidermidis is not able to detach from a biofilm in form of single cells. s shown by confocal laser microscopy over a time course of 48 hours, bacteria rather die off in the inner zones of the biofilm. By this means, the structure gets instable and more susceptible to shearing forces resulting in detachment and drifting of bacterial clusters which are then transported to novel colonization sites. Therefore, death of a single cell might be an advantage for the clonal survival. This is in accordance with the data of gene expression analyses by microarrays. Moreover, these analyses show that biofilm formation in S. epidermidis is a strongly regulated process under very special physiological conditions. Obviously, biofilm formation leads to a diminished metabolic activity, a higher antibiotic resistant and to a diminished secretion of extracellular proteins and other immunogenic substances which supports the evasion of S. epidermidis from the host immune response. The results on regulation of biofilm formation and the function of the Agr system give interesting new insights into the pathogenicity and physiology of this important pathogen and its survival in the human host. The data provide an excellent theoretical basis for future experimental work aiming at the development of new therapeutic strategies against S. epidermidis infections