Regulation of activatory and inhibitory signalling pathways in neutrophils mediated by cAMP- and cGMP-elevating vasolidators

Neutrophile Granulozyten sind wichtige Effektorzellen des menschlichen Immunsystems. Eine Suppression der Neutrophilen kann zur Immundeffizienz mit Gefahr für bakterielle Erkrankungen und maligne Tumoren führen, eine Überstimulation dieser Zellen ist jedoch an der Entstehung der Autoimmunerkrankungen beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden aktivierende und hemmende Wege untersucht, die für zukünftige Strategien in Prävention und Therapie dieser Erkrankungen eine wichtige Rolle spielen. Neutrophile Granulozyten enthalten VASP in hoher Konzentration. VASP ist ein bereits gut charakterisiertes Substrat der cAMP-PK und der cGMP-PK. Phosphorylierungsversuche mit cAMP-erhöhenden Substanzen ergaben eine rasche, reversible Phosphorylierung dieses Proteins an Ser-157 und Ser-239 in intakten humanen Neutrophilen Granulozyten. Versuche mit cGMP-erhöhenden Substanzen zeigten jedenfalls eine Phosphorylierung am Ser-157, jedoch keine Phosphorylierung am Ser-239. Diese Ergebnisse unterstreichen deutlich das Vorhandensein und die physiologische Funktion der cAMP-PK bezüglich der Phosphorylierung von VASP, stellen jedoch die Funktion der cGMP-PK in humanen Neutrophilen Granulozyten in Frage. Basierend auf der Methode der Immunfluoreszenz wurde gezeigt, dass VASP bei der Adhärenz der Neutrophilen eine entscheidende Rolle spielt. So ist mit Hilfe der spezifischen monoklonalen Antikörper eine Phosphorylierung am Ser-157 und am Ser-239 nach der Adhäsion der Neutrophilen an die Objektträger nachgewiesen worden. Nach zusätzlicher Stimulation mit PG-E1 zeigte sich kein wesentlicher Phosphorylierungsanstieg in adhärierten Neutrophilen. Zahlreiche chemotaktische Faktoren wie fMLP führen zur Phosphorylierung der p42/p44-, p38-MAPK sowie auch der PKB. Diese intrazellulären Signalmoleküle spielen eine zentrale Rolle bei der Neutrophilenaktivierung. Da es bereits von hemmenden Einflussen der Vasodilatatoren auf die Aktivierung der Neutrophilen Granulozyten berichtet worden ist, wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von cAMP- und cGMP-erhöhenden Substanzen auf die fMLP-induzierte Phosphorylierung der p42/p44-, p38-MAPK sowie der PKB untersucht. Flolan, ein cAMP-erhöhender Vasodilatator führte zur signifikanten Hemmung der fMLP-induzierten p42/p44-, p38- sowie PKB-Phosphorylierung. cGMP-erhöhender Vasodilatator SNP zeigte jedoch keinen Einfluss auf die fMLP-induzierte Aktivierung dieser Signalmoleküle. Physiologisch vorkommende cAMP-erhöhende Substanzen besitzen im menschlichen Körper eine wichtige regulatorische Funktion, die Neutrophile Granulozyten vor der „Überstimulation“ bewahrt.Neutrophil granulocytes are critical effector cells in human humoral and innate immunity and play a vital role in phagozytosis and bacterial killing. Patients with deficient function of neutrophils commonly suffer from repeated bacterial infections. Moreover, neutrophils are active in immunosurveillance against tumours. However, the capacity for bacterial killing carries with it an implicit capacity for host tissue destruction, as observed in autoimmune disease. This study is focussed on the characterization of activatory and inhibitory signalling pathways in neutrophils which will allow new approaches in the therapy of cancer, inflammatory and autoimmune diseases. Neutrophils contain high concentrations of VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein). VASP is an established substrate of both cAMP- and cGMP- dependent protein kinases. This study demonstrates that cAMP-elevating drugs cause reversible VASP phosphorylation at serine 157 and at serine 239 in intact human neutrophils, whereas cGMP-elevating drugs cause VASP phosphorylation only at serine 157 but not at serine 239. This indicates that cAMP-dependent protein kinases play a functional role in neutrophils, the physiologic role of cGMP-dependent protein kinases in these cells still remains unresolved. Furthermore, immunofluorescence microscopy demonstrated VASP phosphorylation at serine 157 and serine 239 during neutrophil adhesion. After stimulation of adherent neutrophils with PG-E1 no increase in VASP phosphorylation could be observed compared to unstimulated adherent cells. Multiple chemotactic factors including fMLP cause phosphorylation and activation of p42/p44-MAPK, p38-MAPK and protein kinase B (Akt-kinase, PKB). These are intracellular signalling molecules which play an important role in neutrophil activation. This study investigates the effects of cAMP- and cGMP-elevating drugs on the fMLP-induced phosphorylation of p42/p44-MAPK, p38-MAPK and PKB. The cAMP-elevating prostacyclin I2 (Flolan™) shows inhibition of fMLP-induced phosphorylation of p42/p44-MAPK, p38-MAPK and PKB. The cGMP-elevating drug sodium nitroprusside did not influence fMLP-induced phosphorylation of these signalling molecules. Therefore, physiological cAMP-elevating substances seem to play a regulatory role and prevent neutrophil granulocytes from “overstimulation”