The role of a constitutively active MAP kinase SAPKbeta in cellular transformation, proliferation and apoptosis of NIH 3T3 fibroblasts

Bei c-Jun N-terminalen Kinasen (JNKs) (auch als Stress-aktivierte Proteinkinasen SAPKs bezeichnet), handelt es sich um Mitglieder der Mitogen-aktivierten Proteinkinase Familie (MAPK), die die Genexpression als eine Antwort auf eine Vielzahl von physiologischen und nicht-physiologischen Stimuli regulieren. Gendeletionsexperimente (knockout) und der Einsatz von dominant-negativen Mutanten wiesen auf eine Funktion von SAPK/JNKs bei Prozessen der zellulären Differenzierung, dem Überleben und/oder Apoptose sowie onkogener Transformation hin. Direkte Analysen des transformierenden Potentials von SAPK/JNKs wurden bislang durch das Fehlen von konstitutiv-aktiven Mutanten verhindert. Erst unlängst konnte durch die Fusion der MAP Kinase mit seiner direkten, in der Kaskade vorgeschalteten, Aktivatorkinase solche Mutanten bereitgestellt werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde ein SAPKb-MKK7 Hybridprotein generiert, mit dessen Hilfe das transformierende Potential von aktiviertem SAPKb charakterisiert werden konnte. Die induzierte Expression von SAPKb-MKK7 führte zur morphologischen Transformation von NIH 3T3 Fibroblasten. Darüber hinaus bildeten diese Zellen kleine Foci aus transformierten Zellen, wuchsen in Soft-Agar und vergleichbar mit onkogenem Ras oder Raf, resultierte auch die Expression von aktiviertem SAPKb in der Zerstörung des F-Aktins. Des Weiteren steigerte die Expression von SAPKb-MKK7 die Proliferationsraten von NIH 3T3 Zellen. Im Gegensatz zu den akut transformierenden Onkogenen wie ras oder raf, ist SAPKb-MKK7 jedoch nicht in der Lage, das Überleben der transformierten Zellen zu bewirken. Unsere Daten schlagen daher vor, das konstitutiv-aktives SAPK/JNK zwar die Hauptaspekte zellulärer Transformation verursacht, aber nicht imstande ist, alle Veränderungen zu induzieren, die benötigt werden, um einen vollständig transformierten Phänotypen zu etablieren, weshalb insgesamt gesehen, sein transformierendes Potential deutlich schwächer ausgeprägt ist. Wir haben zusätzlich damit begonnen, dass tumorgene Potential von SAPKb-MKK7 direkt im Nacktmausmodell zu verifizieren. Die Injektion von SAPKb-MKK7 exprimierenden Fibroblasten resultierte in der Etablierung eines gut definierten Fibrosarkoms, wobei die Latenzzeit länger war als bei v-Raf transformierten Zellen. Somit ist die Expression von aktiviertem SAPK/JNK ausreichend, um die Tumorentwicklung in vivo zu initieren, auch wenn die lange Latenzzeit auf die Notwendigkeit zusätzlicher genetischer Veränderungen hinweist.The c-Jun N-terminal kinases (JNKs) (also known as stress-activated protein kinases, SAPKs), members of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) family, regulate gene expression in response to a variety of physiological and environmental stimuli. Gene knockout experiments and the use of dominant interfering mutants have pointed to a role of SAPK/JNKs in the processes of cell differentiation, survival and/or apoptosis as well as oncogenic transformation. Direct analysis of the transforming potential of JNKs has been hampered so far by the lack of constitutively active forms of these kinases. Recently such mutants have become available by fusion of the MAPK with its direct upstream activator kinase. In the context of this PhD thesis a constitutively active SAPKb-MKK7 hybrid protein was generated and used to characterize the transforming potential of activated SAPKb. Inducible expression of SAPKb-MKK7 caused morphological transformation of NIH 3T3 fibroblasts. Additionally, these cells formed small foci of transformed cells, grew anchorage-independent in soft agar and similar to oncogenic Ras and Raf, expression of activated SAPKb resulted in the degradation of F-actin stress fibers. Furthermore, expression of SAPKb-MKK7 increased proliferation rates of NIH 3T3 cells. However, in contrast to the classical oncogenes like ras and raf, SAPKb-MKK7 is not able to selectively support the survival of the transformed cells. Therefore, our data suggest that constitutive SAPK/JNK activation elicits major aspects of cellular transformation, but is unable to induce the complete set of changes which are required to establish the fully transformed phenotype. We have also begun to directly determine the tumorigenic potential of SAPKb-MKK7 in the nude mouse. Injection of SAPKb-MKK7 expressing fibroblasts resulted in the establishement of a well defined fibrosarcoma, albeit at much later timepoints than in the case of v-Raf transformed cells. The long latency with which they develop tumors suggests the requirement of further genetic alterations. Thus expression of activated SAPK/JNK is sufficient to initiate tumor development in vivo