PH-regulated genes of the pathogenic yeast Candida dubliniensis and their impact in epidemiological diagnostics

Candida dubliniensis ist eine 1995 erstmals beschriebene pathogene Hefespezies mit enger phylogenetischer Verwandtschaft zu Candida albicans. Sie wird mittels routinemäßig angewendeter Verfahren nicht von C. albicans unterschieden, weil sie als einzige Spezies im Genus Candida neben C. albicans Chlamydosporen ausbilden kann. C. dubliniensis ist bisher vor allem aus dem Oropharynx HIV-positiver Patienten isoliert worden. PHR1 und PHR2 sind funktionell homologe, pH-abhängig exprimierte Gene von C. albicans, deren Produkte essentiell für die Verknüpfung von b-1,3- und b-1,6-Glukan in der Zellwand sind. Die Deletion jedes dieser Gene führt zu einem pH-abhängigen Phänotyp mit aberranter Morphogenese in vitro und reduzierter Virulenz im Tiermodell. In dieser Arbeit werden PHR homologe Gene im Genom von C. dubliniensis charakterisiert. CdPHR1 weist eine Homologie von 90,5 Prozent zu PHR1 und CdPHR2 eine Homologie von 91,7 Prozent zu PHR2 auf. Wie PHR1 wird auch CdPHR1 nur unter neutralen und alkalischen Bedingungen exprimiert, während sich CdPHR2 Transkript, wie das von PHR2, nur unter sauren Bedingungen nachweisen lässt. Die funktionelle Homologie von CdPHR1 zu PHR1 wird durch Komplementation des Phänotyps einer C. albicans phr1 Mutante mit CdPHR1 gezeigt. Dabei erweist sich der native Promoter von CdPHR1 als funktional in C. albicans. Im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae wird CdPHR1 unter Kontrolle seines nativen Promotors dagegen pH-unabhängig exprimiert. Auch die zusätzliche Einführung eines mutierten, dominant aktiven Allels von RIM101, das in C. albicans für die pH-abhängige Genexpression verantwortlich ist, hat darauf keinen Einfluss. In C. glabrata und Aspergillus nidulans findet sich keine Expression von CdPHR1. Basierend auf Sequenzunterschieden zwischen PHR1 und CdPHR1 wird ein PCR-Schnelltest zur Speziesunterscheidung entwickelt. Dieser wird in einer epidemiologischen Studie mit 133 chlamydosporenpositiven klinischen Isolaten evaluiert. 21 oropharyngeale Isolate von 14 HIV-positiven Patienten können so retrospektiv als C. dubliniensis klassifiziert werden, dies entspricht einer Prävalenz von C. dubliniensis in diesem Kollektiv von 30 Prozent. Die Ergebnisse der PCR werden durch Sequenzierung ribosomaler Gene (V3, ITS1, ITS2) bestätigt. Parallel werden phänotypische Tests zur Identifizierung von C. dubliniensis auf ihre diagnostische Validität getestet. Während sich die Chlamydosporenmorphologie der Isolate und die Koloniefärbung auf dem Farbindikatormedium CHROMagar Candida als unzulänglich für die Unterscheidung erweisen und das für C. dubliniensis beschriebene Wachstumsdefizit bei 45°C zwar sensitiv, nicht aber spezifisch für die Identifizierung dieser Spezies ist, korreliert die Koloniemorphologie auf Staib-Agar zu 100 Prozent mit den molekularen Daten. Alle C. dubliniensis Isolate werden in einem biochemischen Assay (Micronaut RC) untersucht, dabei zeigt der Test auf b-Glukosidase Aktivität hohes diskriminatorisches Potenzial. In Resistenztestungen zeigen sich die C. dubliniensis Isolate sensibler als die oropharyngealen C. albicans Isolate gegen gebräuchliche Antimykotika. In dieser Studie kann gezeigt werden, dass C. dubliniensis und C. albicans auf teilweise austauschbare Mechanismen zur Reaktion auf Alterationen des pH-Milieus verfügen. Die pH-abhängige Regulation zellwandassoziierter Gene ist dabei eng mit morphogenetischen Prozessen verbunden. Trotz dieser Ähnlichkeit ist C. dubliniensis nicht nur weniger virulent als C. albicans, sondern zeigt auch ein unterschiedliches epidemiologisches Spektrum, das durch eine Spezialisierung auf oropharyngeale Kolonisation und Infektion bei HIV-positiven Patienten gekennzeichnet ist. Um die Gründe für diese Unterschiede aufzeigen zu können, ist eine verlässliche Identifizierung von C. dubliniensis notwendig. Dazu stellen die präsentierten Daten einerseits einen schnellen und verlässlichen PCR Test, andererseits eine sorgfältige Evaluierung derzeit gebräuchlicher phänotypischer Verfahren vor. Phänotypisch und genotypisch exzellent charakterisierte Isolate beider Spezies stehen für weitere Untersuchungen zur Verfügung.Candida dubliniensis is a recently described pathogenic yeast species that is phylogenetically closely related to Candida albicans. In routine clinical diagnostic procedures both species are not differentiated due to the unique ability of C. dubliniensis to form germ-tubes and chlamydospores as C. albicans. Most C. dubliniensis isolates have been recovered from the oropharynx of HIV-infected patients. PHR1 and PHR2 are functionally homologous genes of C. albicans responsible for crosslinking b-1,3- and b-1,6-glucans of the yeast cell wall. These genes are characterized by a unique pattern of pH-dependent transcription. Deletion of each of these genes results in a pH-dependent phenotype with aberrant in vitro morphogenesis and reduced virulence in an animal model. Here, PHR homologous genes of C. dubliniensis are characterized. CdPHR1 is 90.5 per cent homologous to PHR1, CdPHR2 is 91.7 per cent homologous to PHR2. Like PHR1, CdPHR1 is only expressed in neutral to alkaline conditions, whereas CdPHR2 transcript - as with PHR2 - can only be found in acidic conditions. Functional homology of CdPHR1 with PHR1 is shown by complementation of a phr1 phenotype in C. albicans with CdPHR1. The native promoter of CdPHR1 is thereby shown to be functional in C. albicans. In contrast CdPHR1 is expressed in a pH-independent manner in bakers yeast Saccharomyces cerevisiae. This constitutive expression is not altered by additional integration of a dominant active allele of RIM101, encoding the transcription factor, that ensures pH-dependent gene expression in C. albicans. CdPHR1 is not expressed in C. glabrata and Aspergillus nidulans. A rapid PCR-test for discrimination between C. albicans and C. dubliniensis is constructed based on sequence differences between PHR1 and CdPHR1. This test is evaluated in an epidemiological study with 133 chlamydospore-positive clinical yeast isolates. 21 oropharyngeal isolates are retrospectively identified as C. dubliniensis, resulting in a prevalence of 30 per cent in this patient collective. PCR-results are confirmed by sequencing rDNA (V3, ITS1, ITS2). Phenotypic tests for identification of C. dubliniensis are evaluated with respect to their diagnostic potential. Whereas chlamydospore-morphology and colony colour on Chromagar Candida are not suited for reliable discrimination, and the growth deficit of C. dubliniensis at 45°C is sensitive but not specific, colony morphology on Staib agar corresponds 100 per cent to the molecular biology data. All C. dubliniensis isolates are biochemically characterized using the Micronaut RC system. The test for b-glucosidase activity within this system shows a high discriminatory potential. Susceptibility testing reveals, that the C. dubliniensis isolates are more sensitive to antifungals than the C. albicans isolates. C. dubliniensis and C. albicans rely on interchangeable mechanisms to react to the ambient pH. Furthermore, pH-regulated expression of cell wall associated genes is closely linked to morphogenesis. Despite this, C. dubliniensis is not only less virulent than C. albicans but also displays a distinct epidemiology characterized by a preference for oropharyngeal colonialization and infection of HIV-positive patients. To reveal the reasons for this, reliable identification of C. dubliniensis is necessary. For that purpose, a rapid PCR test is introduced together with an evaluation of currently available phenotypic methods. Thoroughly characterized isolates of both species are available for further studies