Chitin and peptidoglycan deacetylases: discovery, characterization and engineering

Les desacetilases de quitina (CDAs) i les desacetilases de peptidoglicà són membres de la família 4 de les esterases de carbohidrats (CE4), que també inclou desacetilases de poli- β1,6-N-acetilglucosamina i esterases d’acetilxilà. El peptidoglicà és un dels components principals de la paret cel·lular bacteriana. Els bacteris patògens utilitzen l’acetilació (6-O-acetilació de MurNAc) i desacetilació (2-N-desacetilació de residus de GlcNAc i/o MurNac) del seu propi peptidoglicà per evadir la detecció pel sistema immunitari innat de l’hoste, havent sigut les desacetilases de peptidoglicà proposades com a noves dianes antibacterianes. La desacetilació de residus de MurNAc del peptidoglicà també està involucrada amb la formació d’endòspores i la germinació. Els quitosans i els oligosacàrids de quitosà (COS) són molècules bioactives amb diverses aplicacions, conegudes i potencials, en varis camps, i les seves propietats fisicoquímiques i biològiques estan determinades per les seves estructures específiques. Hi ha un interès creixent pel desenvolupament d’aproximacions enzimàtiques per la producció d’oligòmers de quitosà definits per tal d’avaluar-ne les funcions biològiques i desenvolupar noves aplicacions, presentant els enzims de la família CE4 un gran potencial pel seu ús com a biocatalitzadors. Amb l’objectiu d’incrementar el coneixement disponible sobre l’especificitat de les desacetilases de quitina i peptidoglicà en diferents substrats i les característiques seqüencials i estructurals que determinen aquestes especificitats, aquest treball reporta la caracterització exhaustiva de la desacetilasa de peptidoglicà PdaC del microorganisme Bacillus subtilis (BsPdaC), així com la selecció i caracterització de nous enzims de la família CE4. La cinètica de desacetilació amb COS ha revelat que BsPdaC actua seguint un mecanisme de cadena múltiple, essent el GlcNAc3 el seu substrat mínim, i que la seva activitat augmenta amb el grau de polimerització del glicà. S’ha determinat l’estructura de rajos x del domini CE4 de BsPdaC i la comparació estructural amb desacetilases canòniques de MurNAc i GlcNAc ha dut a proposar que, en base a les seves característiques funcionals i estructurals diferencials, PdaC és el primer membre d’una nova subclasse de desacetilases de MurNAc amb funcions biològiques encara desconegudes. A més, s’ha destacat, mitjançant un anàlisi mutacional, la importància d’una sèrie d’interaccions enzim-substrat, i s’ha alterat l’especificitat i el patró de desacetilació mutant un residu que forma interaccions clau amb el substrat. Es presenta la cerca de nous enzims CE4 basat en un anàlisi filogenètic i bioinformàtic de la família. S’han seleccionat diverses noves seqüències i s’ha realitzat la caracterització inicial de les proteïnes recombinants, d’entre les quals s’ha identificat la CDA de Tilletia controversa com una nova desacetilasa de quitina i s’ha proposat la proteïna Pda de Bacillus cereus com una nova desacetilasa de MurNac per la seva caracterització addicional.Las desacetilasas de quitina (CDAs) y las desacetilasas de peptidoglicano son miembros de la familia 4 de las esterases de carbohidratos (CE4), que también incluye desacetilasas de poli-β1,6-N-acetilglucosamina y esterases de acetilxilano. El peptidoglicano es uno de los principales Componentes de la pared celular bacteriana. Las bacterias patógenas utilizan la acetilación (6-O-acetilación de MurNAc) y desacetilación (2-N-desacetilación de residuos de GlcNAc y/o MurNac) de su propio peptidoglicano para evadir la detección por el sistema inmunitario innato del huésped, habiendo sido las desacetilasas de peptidoglicano propuestas como nuevas dianas antibacterianas. La desacetilación de residuos de MurNAc del peptidoglicano también está relacionada con la formación de endosporas y la germinación. Los quitosanos y los oligosacáridos de quitosano (COS) son moléculas bioactivas con diversas aplicaciones, conocidas y potenciales, en varios campos, y sus propiedades fisicoquímicas y biológicas están determinadas por sus estructuras específicas. Existe un interés creciente en el desarrollo de aproximaciones enzimáticas para la producción de oligómeros de quitosano definidos para evaluar sus funciones biológicas y desarrollar nuevas aplicaciones, presentando las enzimas de la familia CE4 un gran potencial para su uso como biocatalizadores. Con el objetivo de incrementar el conocimiento disponible en relación con la especificidad de las desacetilasas de quitina y peptidoglicano en diferentes sustratos y con las características secuenciales y estructurales que determinan estas especificidades, este trabajo reporta la caracterización exhaustiva de la desacetilasa de peptidoglicano PdaC de Bacillus subtilis (BsPdaC), así como la selección y caracterización de nuevas enzimas de la familia CE4. La cinética de desacetilación con COS ha revelado que BsPaC actúa siguiendo un mecanismo de cadena múltiple, siendo GlcNAc3 su sustrato mínimo, y que su actividad aumenta con el grado de polimerización del glicano. Se ha determinado la estructura de rayos x del dominio CE4 de BsPdaC y la comparación estructural con desacetilasas canónicas de MurNAc y GlcNAc ha llevado a proponer que, en base a sus características funcionales y estructurales diferenciales, PdaC es el primer miembro de una nueva subclase de desacetilasas de MurNAc con funciones biológicas todavía desconocidas. Además, se ha destacado la importancia de una serie de interacciones enzima-sustrato, y se ha alterado la especificidad y el patrón de desacetilación mutando un residuo que forma interacciones clave con el sustrato. Se presenta una búsqueda de nuevas enzimas CE4 basada en el análisis filogenético y bioinformático de la familia. Se han seleccionado diversas nuevas secuencias y se ha realizado la caracterización inicial de las proteínas recombinantes, de entre las cuales se ha identificado la CDA de Tilletia controversa como una nueva desacetilasa de quitina y se ha propuesto la proteína Pda de Bacillus cereus como una nueva desacetilasa de MurNAc para su caracterización adicional.Chitin deacetylases (CDAs) and peptidoglycan deacetylases are members of family 4 carbohydrate esterases (CE4-enzymes), which also includes poly-β1,6-N-acetylglucosamine deacetylases and some acetylxylan esterases. Peptidoglycan is a major component of the bacterial cell wall. Pathogenic bacteria utilize acetylation (6-O-acetylation of MurNAc) and deacetylation (2-N-deacetylation of GlcNAc and/or MurNAc residues) of its own cell wall peptidoglycan to evade detection by the host’s innate immune system, with peptidoglycan deacetylases being proposed as novel antibacterial targets. Deacetylation of MurNAc residues of peptidoglycan is also involved in endospore formation and germination. Chitosans and chitooligosacharides (COS) are bioactive molecules with many current and potential new applications in several fields, and their physicochemical and biological properties are determined by their specific structures. There is a growing interest in developing selective enzymatic approaches to produce sequence-defined chitooligosaccharides to evaluate their biological functions and develop new applications, with CE4 enzymes showing great potential for their use as biocatalysts. Aiming to increase the available knowledge regarding the specificity of chitin and peptidoglycan deacetylases from CE4 family on different substrates and the sequential and structural features determining these specificities, this work reports the comprehensive characterization of the peptidoglycan deacetylase PdaC from Bacillus subtilis (BsPdaC), as well as the selection and characterization of novel CE4 enzymes. COS deacetylation kinetics has revealed that BsPdaC operates by a multiple-chain mechanism, with GlcNAc3 being the minimal substrate, and that the activity increases with the degree of glycan polymerization. The x-ray structure of the BsPdaC CE4 domain has been determined and the structural comparison with canonical MurNAc and GlcNAc deacetylases has led to propose that PdaC is the first member of a new subclass of peptidoglycan MurNAc deacetylases, with yet unknown biological functions, based on the differential functional and structural characteristics. Furthermore, the importance of key enzyme-substrate interactions has been highlighted by mutational analysis and the specificity and pattern of deacetylation has been altered by mutating a key substrate-interacting residue. The search for new CE4 enzymes based on a phylogenetic and bioinformatic analysis of the family is presented. Several new sequences have been selected and the recombinant proteins initially characterized, from which Tilletia controversa CDA has been identified as a novel CDA and Bacillus cereus Pda has been proposed as a novel MurNAc deacetylase for further characterization