Unravelling the pathobiological diversity of highly pathogenic avian influenza in birds

La influença aviària (IA) es considera una de les malalties virals més importants que afecten la indústria avícola i una amenaça contínua per a la població humana i la vida salvatge. Fins a la data, no hi ha una comparació sistemàtica de la patobiologia de virus d’IAAP clàssics i Gs/GD H5 en espècies aviars de differentes grups taxonòmics i races. A la present tesi, es va avaluar sistemàticament les característiques patobiològiques diferencials d’un virus d’IA d’alta patogenicitat (VIAAP) pertanyent a un llinatge clàssic (H7N1) i un del llinatge Gs/GD H5 (H5N8) en diferents races de gallines (Gallus gallus domesticus), oques domèstiques (Anser anser var. domestica) i els coloms (Columba livia var. domestica). A l'estudi I, les anàlisis filogenètiques de l'H5N8 aïllat a Espanya a principis del 2017 van indicar que pertany al clade 2.3.4.4 grup B del llinatge Gs/GD H5 dels virus, i presentaven una alta identitat de nucleòtids amb VIAAP H5N8 prèviament aïllats a Europa, Àfrica i Àsia. La caracterització d'aminoàcids va revelar diverses substitucions d'aminoàcids associades a un fenotip en pollastres, ànecs i mamífers, però els marcadors més comuns de transmissió i virulència a humans no hi eren presents. A l'estudi II, tant el VIAAP H7N1 com l’H5N8 varen produir infeccions letals als pollastres, però l’H7N1 és més virulent en comparació amb l’H5N8 basat en les mortalitats més elevades i el temps mig de mortalitat mitjà més curt. El nombre relativament inferior de pollastres inoculats amb el VIAAP H5N8 amb excreció cloacal suggereix que la transmissió horitzontal d’aquest virus podria estar afectada. La replicació viral relativament més elevada de l’H7N1 al cervell de pollastres suggereix que les mortalitats més altes podrien estar associades a l’intens neurotropisme d'aquesta soca. Les races locals varen ser més susceptibles a la infecció per VIAAP que les races comercials, demostrant així que les races locals no presenten necessàriament una major resistència a aquests virus. A l'estudi III, totes les oques domèstiques inoculades amb H5N8 van sucumbir a la infecció, demostrant que el clade Gs/GD 2.3.4.4 H5N8 dels VIAAP que circulaven a Europa el 2016/2017 van adquirir una alta virulència per a aquesta espècie. H5N8 va produir una infecció sistèmica, i les aus probablement van morir a causa d’una disfunció neurològica o una fallada de diversos òrgans. L’elevada excreció i la detecció d’ARN viral a l’aigua de la piscina indiquen que aquesta espècie podria tenir un paper important en l’epidemiologia d’aquest virus. La manca de signes clínics, però la detecció d’ARN viral i la seroconversió demostren que diverses oques es van infectar subclínicament amb el VIAAP H7N1. Es va detectar excreció oral en diverses oques, cosa que suggereix que poden tenir un paper en l'epidemiologia dels llinatges H7 clàssics dels VIAAP. A l'estudi IV, els VIAAP H7N1 i H5N8 van causar infeccions subclíniques en coloms, com es demostra per la falta de signes clínics de malaltia, però seroconversió i detecció d’excreció viral en diverses aus. Un colom inoculat amb el VIAAP H5N8 presentava signes nerviosos greus i presentava lesions microscòpiques greus associades a un antigen AIV generalitzat al cervell. Per tant, demostrem per primera vegada que el VIAAP H5N8 Gs/GD 2.3.4.4 poden causar infeccions letals en els coloms per una disfunció neurològica. L’excreció viral en coloms inoculats amb VIAAP H7N1 i H5N8 va ser baixa, però, atès l’àmplia utilització d’hàbitat d’aquesta espècie, s’han de valorar més les implicacions biològiques d’aquests resultats. En conjunt, la present tesi demostra que el resultat clínico-patològic i l’excreció viral després de la infecció amb els VIAAP varien en gran mesura segons el virus i l’hoste, posant de manifest la necessitat d’estudiar la patobiologia d’aquests virus en diferents combinacions virus-hoste. Tenint en compte les grans diferències, aquestes dades també representen un punt de partida per estudiar els factors virals i hostes associats als resultats observats.Avian influenza (AI) is considered one of the most important viral diseases affecting the poultry industry and a continuous threat to human population and wildlife. To date, a direct comparison of the pathobiology of classical and Gs/GD H5 HPAIVs in avian species belonging to distinct taxonomic groups and breeds is lacking. In the present dissertation we systematically evaluated the differential pathobiological features of a highly pathogenic AI virus (HPAIV) belonging to a classical lineage (H7N1) and a HPAIV of Gs/GD H5 lineage (H5N8) in different breeds of chickens (Gallus gallus domesticus), domestic geese (Anser anser var. domestica) and pigeons (Columba livia var. domestica). In Study I, the phylogenetic analyses of the H5N8 isolated in Spain in early 2017 indicated that belongs to clade 2.3.4.4 Group B of Gs/GD H5 lineage of HPAIVs, and presented high nucleotide identity with H5N8 HPAIVs previously isolated in Europe, Africa and Asia. The amino acid characterization revealed several amino acid substitutions associated to a phenotype in chickens, ducks and mammals, but the most common markers of human transmission and virulence were lacking. In Study II, both H7N1 and H5N8 HPAIVs were highly lethal for chickens, but H7N1 HPAIV is more virulent for chickens than H5N8 HPAIV based on the higher mortalities and shorter mean death time. The comparatively lower number of chickens inoculated with H5N8 HPAIV presenting cloacal excretion suggests that the horizontal transmission of this virus could be affected. The comparatively higher viral replication of H7N1 HPAIV in the brain of chickens inoculated with this virus suggest that the higher mortalities could be associated with the higher neurotropism of this strain. Local breeds were more susceptible to HPAIV infection than commercial breeds, demonstrating that local breeds do not necessarily present a higher resistance to HPAIVs. In Study III, all domestic geese inoculated with H5N8 HPAIV succumbed to infection, demonstrating that Gs/GD clade 2.3.4.4 H5N8 HPAIVs circulating in Europe in 2016/2017 acquired high virulence for this species. H5N8 HPAIV produced a systemic infection, and the birds likely died as a result of neurological dysfunction or multi-organ failure. The high excretion and the detection of AIV RNA in pool water indicate that this species could play an important role in the epidemiology of this virus. The lack of clinical signs but detection of viral RNA and the seroconversion demonstrate that several geese became subclinically infected with H7N1 HPAIV. Oral shedding was detected in several geese, suggesting that they may play a role in the epidemiology of classical lineages of H7 HPAIVs. In Study IV, H7N1 and H5N8 HPAIVs caused subclinical infections in pigeons, as demonstrated by the lack of clinical signs of disease but seroconversion and detection of viral shedding in several birds. One pigeon inoculated with H5N8 HPAIV presented severe nervous signs and presented severe microscopic lesions associated to widespread AIV antigen in the brain. Therefore, we demonstrate for the first time that Gs/GD clade 2.3.4.4 H5N8 HPAIVs could potentially cause lethal infections in pigeons by neurological dysfunction. The viral shedding in pigeons inoculated with H7N1 and H5N8 HPAIVs was low, but given the wide habitat use of this species, the biological implications of the viral shedding detected here should be further assessed. Taken together, the present dissertation demonstrates that the clinico-pathological outcome and viral shedding after infection with HPAIVs varies largely depending on the virus and the host, highlighting the necessity to study the pathobiology of HPAIVs in different virus-host combinations. Considering the broad differences, this data also represents a start point to study viral and hosts factors associated with the observed results