Estabelecimento de metodologia de isolamento e cultivo primário de hepatócitos bovinos para estudos do efeito modulador da saliva do carrapato Rhipicephalus microplus sobre expressão de genes relacionados à imunidade inata

Innate immunity is the body's first line of defense against injury and invasion of microorganisms. The complement system plays a key role in mediating acquired and innate responses in defense against microbial and parasitic infections. In cattle, the response against tick infestations leads the innate immunity cells in the injured tissue to produce pro-inflammatory cytokines, signaling the onset of a more specific response, such as the production of acute-phase proteins (APPs). Approximately 80 to 90% of the plasma components of complement and APPs are produced in the liver and released systemically for the control of inflammatory reactions. There are well-established methods of isolation and culture of hepatocytes for in vitro studies, as well as commercial lines for human and murine, however for bovines there are no well-established methodologies for isolation of hepatocytes or commercial cell lines available for cultivation of this subtype. The bovine tick, Rhipicephalus microplus, is a parasite that causes great economic losses for the world livestock. It is known that bovine breeds differ in tick resistance, with the Bos indicus breeds being more resistant compared to the Bos taurus breeds. Since there are differences in the production of complement and APP molecules among resistant and susceptible ticks, this work aimed to establish a methodology for the primary isolation and in vitro culture of bovine hepatocytes to verify the modulatory effect induced by the R. microplus tick saliva on the expression of genes related to innate immunity, such as complement factors (C1, C3, C4, C5, mannose binding lectin) and APPs (Alpha 1 acid glicoprotein, haptoglobin e serum amyloid A). For this purpose, several protocols of isolation and primary culture of hepatocytes were evaluated. We were able to establish the methodology with high cellular viability, morphological features and quality of the genetic material. Gene expression analysis suggested that hepatocytes cultured in vitro might be losing the physiological features, since the expression of some genes was not detected in cultured cells. Although the stimuli used as a positive control have upregulated the expression of the SAA encoding gene, the same behavior has not been observed in complement genes regulated by the same signaling pathway in murine model. In addition, no significant difference was observed between breeds in the expression of the evaluated genes against the stimuli of tick saliva and nuclear receptor modulating agent related to the hepatic control of murine inflammation. Our results suggest that the primary isolation and in vitro culture of bovine hepatocytes might be causing loss of function of these cells, and further investigation is needed to better understand the physiological processes performed by hepatocytes.A imunidade inata é a primeira linha de defesa do organismo contra lesões e invasões de micro-organismos. O sistema complemento desempenha um papel importante na mediação das respostas adquiridas e inatas na defesa contra infecções microbianas e parasitárias. Em bovinos, a resposta contra infestações por carrapato faz com que células da imunidade inata, residentes no tecido lesado, produzam citocinas pró-inflamatórias, sinalizando para o início de uma resposta mais específica, como a produção de proteínas de fase aguda (PFAs). Cerca de 80 a 90% dos componentes plasmáticos do complemento e proteínas de fase aguda são produzidas no fígado e liberadas sistemicamente para o controle de reações inflamatórias. Já existem metodologias bem estabelecidas de isolamento e cultivo de hepatócitos para estudos in vitro, bem como linhagens comerciais para humanos e murinos, no entanto para bovinos não existem metodologias de isolamento de hepatócitos bem estabelecidas, nem linhagens comerciais disponíveis para cultivo desse subtipo celular. O carrapato bovino, Rhipicephalus microplus, é um parasito que provoca perdas econômicas para a pecuária mundial. É sabido que raças bovinas diferem quanto à resistência ao carrapato, sendo as raças Bos indicus mais resistentes em comparação com as raças Bos taurus. Visto que existem diferenças na produção de moléculas do complemento e PFA entre bovinos resistentes e susceptíveis ao carrapato, este trabalho objetivou estabelecer uma metodologia de isolamento primário e cultivo in vitro de hepatócitos bovinos para verificar o efeito modulador induzido pela saliva do carrapato R. microplus sobre a expressão de genes relacionados à imunidade inata, tais como os fatores do complemento (C1, C3, C4, C5, lectina ligante de manose) e proteínas de fase aguda (Alpha 1 glicoproteína ácida, haptoglobina e amiloide sérica A). Para tal, foram avaliados diversos protocolos de isolamento e cultivo primário de hepatócitos, onde foi estabelecida a metodologia com maior viabilidade celular, qualidade morfológica e do material genético extraído. As análises de expressão gênica sugeriram que o modelo de cultivo in vitro pode não estar mantendo as características fisiológicas dos hepatócitos, visto que a expressão de alguns genes estava mais baixa nas células cultivadas quando comparada ao tecido hepático fresco. Embora os estímulos utilizados como controle positivo tenham regulado positivamente a expressão do gene que codifica a SAA, o mesmo não foi observado nos genes do complemento que são regulados pela mesma via de sinalização em murinos. Além disso, não foi observada diferença significativa entre as raças na expressão dos genes avaliados frente aos estímulos de saliva de carrapato e agente modulador de receptor nuclear relacionado com o controle hepático de inflamação em murinos. Os resultados obtidos sugerem que o isolamento primário e cultivo in vitro de hepatócitos bovinos podem estar provocando perda de função destas células, sendo necessárias maiores investigações em busca de melhor compreensão acerca dos processos fisiológicos desempenhados pelos hepatócitos