Modulação da genisteína sobre os receptores toll like e a imunidade adaptativa durante o desenvolvimento da encefalomielite autoimune experimental

Multiple sclerosis (MS) and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), its animal model, are both characterized by immune-mediated neuroinflammation and demyelination in the central nervous system (CNS). The treatments for MS, including IFN-β, are intended to reduce the number of relapses and slow the progression of the disease. However, these treatments are only partially effective, suggesting the need to develop new therapies. The toll-like receptors (TLRs) are patterns-recognition receptors, of the innate immune system, that play important roles in the initiation of inflammatory responses and induction of adaptive immunity. Its role in the pathogenesis of autoimmune diseases have been demonstrated and it was also shown that TLR ligands can suppress EAE. Genistein is a phytoestrogen obtained from soybeans with anti-inflammatory properties. Some studies showed beneficial effects on EAE treatment, suggesting therapeutic potential in MS. However, the work done to date, used a treatment protocol after the onset of clinical signs of the disease and did not address the innate immune response. In this context, the present work aims to evaluate the modulation of innate immune response, and its influence in the adaptive immune response, through the TLRs, using a treatment protocol prior the onset of the clinical signs of the EAE, by evaluating the parameters in the beginning of the development of the disease. EAE was induced in C57BL/6 females with MOG35-55 peptide. The animals were treated or not with 200mg/kg/day of genistein, subcutaneously, in the period between 2 days before induction and until the day 6 after induction of EAE. Laboratory parameters were evaluated in the spinal cord in the day 7 after induction and clinical signs monitored until day 21 after induction. Treatment with genistein resulted in delayed onset and reduced score of disease, concomitant with reduced cellular infiltration and demyelination in the spinal cord, reinforcing its neuroprotective potential in autoimmune diseases. Additionally, it was observed an increase in the median fluorescence intensity of TLR3 and TLR9 in macrophages and dendritic cells and decrease of TLR2 in dendritic cells in the spinal cord. The signaling via TLR3 and TLR9 is related to increase the production of IFN-β. In fact, treatment with genistein increases mRNA expression for IFN-β in the spinal cord. The levels of IL-6, IL-12p40 and CCL5 were reduced. Furthermore, the expression of ROR-γT and T-bet were decreased, and, together with increased production of TGF-β, suggest the development of a regulatory environment. These results heighten the therapeutic potential of genistein in the treatment of EAE and MS, suggesting that its use, including as a supplement or soy-enriched diet, could preventing new outbreaks.A esclerose múltipla (EM) e o seu modelo animal de estudo, a encefalomielite autoimune experimental (EAE), são caracterizadas por neuroinflamação imunomediada e desmielinização no sistema nervoso central (SNC). Os tratamentos para a EM normalmente incluem o interferon-β (IFN-β) e destinam-se a reduzir o número de surtos e retardar a progressão da doença. No entanto, são apenas parcialmente eficazes, sugerindo a necessidade do desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. Os receptores toll like (TLRs) são receptores de reconhecimento de padrões do sistema imune inato e desempenham importante papel na iniciação de respostas inflamatórias e na indução da imunidade adaptativa. A sua participação na patogênese de doenças autoimunes têm sido estudada e foi também demonstrado que ligantes de TLRs podem suprimir a EAE. A genisteína é um fitoestrógeno obtido da soja com propriedades anti-inflamatórias. Alguns estudos mostraram seus efeitos benéficos na EAE e resultados promissores que sugerem potencial terapêutico na EM. Entretanto, os trabalhos realizados até o momento, utilizavam um protocolo de tratamento após o aparecimento dos sinais clínicos da doença e não abordavam a resposta imune inata. Neste contexto, o presente trabalho busca avaliar a modulação da resposta imune inata e a influência desta na resposta imune adaptativa, através dos TLRs, utilizando um tratamento com genisteína anterior ao aparecimento dos sinais clínicos da EAE, avaliando também os parâmetros no início do desenvolvimento da doença. Para isso, a EAE foi induzida em camundongos C57BL/6 fêmeas com o peptídeo MOG35-55 tratados ou não com genisteína. O tratamento com 200mg/kg de massa corporal por dia, via subcutânea, foi realizado do período -2 dias antes da indução até o dia +6 após a indução da EAE. Os parâmetros laboratoriais foram avaliados na medula espinhal no 7° dia pós indução e os sinais clínicos acompanhado s até o 21° dia pós indução. O tratamento com genisteína resultou em atraso no aparecimento e redução na pontuação dos sinais clínicos, concomitante à redução do infiltrado celular e da desmielinização da medula espinhal, reforçando seu potencial neuroprotetor em doenças autoimunes. Adicionalmente, foi observado aumento na intensidade mediana de fluorescência de TLR3 e TLR9 em macrófagos e células dendríticas e diminuição de TLR2 em células dendríticas, presentes na medula espinhal. A sinalização via TLR3 e TLR9 vêm sendo relacionada à maior produção de IFN-β em doenças autoimunes. De fato, o tratamento com genisteína aumentou a expressão relativa de RNAm para IFN-β na medula espinhal. Os níveis das citocinas próinflamatórias IL-6, IL-12p40 e da quimiocina CCL5 foram reduzidos. Além disso, foi observado diminuição na expressão dos fatores de transcrição RORγT e T-bet e aumento na produção da citocina TGF-β, sugerindo o estabelecimento de um ambiente imuno regulador. Estes resultados reforçam o potencial terapêutico da genisteína no tratamento da EAE e da EM, sugerindo que o seu uso, inclusive na forma de suplementação ou alimentação rica em soja, poderia se aliar a terapias já estabelecidas, melhorando o quadro clínico da doença e prevenindo novos surtos