암세포 침윤에 영향을 끼치는 인간 유래 FAM129B/MINERVA 단백질의 구조 연구

학위논문(박사)--서울대학교 대학원 :약학대학 약학과,2020. 2. 한병우.MINERVA (Melanoma invasion by Erk) also known as FAM129B is a member of FAM129 protein family only present in vertebrates. MINERVA is involved in key signaling pathways including EGFR/Erk and Wnt/β-catenin and found upregulated in many types of cancer to promote invasion. However exact function of the protein remain elusive. X-ray crystallographic methods were implemented in order to determine structure of MINERVA9–553, lacking C-terminal flexible region. Trypsin-digestion was required before crystallization to obtain diffraction-quality crystals. While the N-terminal PH domain exhibits typical fold of a PH domains, amino acid composition at its ligand binding site directs affinity for specific lipids. The following helix-rich domain demonstrates a novel fold. The overall structure of MINERVA9–553 hints possible plasma membrane association, which seem to be tightly regulated by its C-terminal flexible region. Elucidation of MINERVA9–553 structure presents a new fold for an α-helix bundle domain and a mechanism for autoregulation of its PH domain to be pursued at the same time.FAM129B라는 이름으로도 알려진 MINERVA (Melanoma invasion by Erk) 단백질은 척추동물에만 존재하는FAM129 단백질 군의 일원이다. MINERVA는 EGFR/Erk와 Wnt/β-catenin를 비롯한 다양한 신호전달체계에 관련되어 있으며 많은 종류의 암에서 발현이 증가하여 암세포 침윤을 유발하는 것이 보고되었다. 그러나, MINERVA의 정확한 작용기전은 알려져 있지 않다. 본 논문에서는C-말단의 유연 부위가 제거된MINERVA9–553 의 구조를 X-선 결정학 방법을 통하여 규명하였다. 구조를 규명하기에 충분한 회절을 하는MINERVA9–553 결정을 얻는데 있어 Trypsin 소화과정이 필수적이었다. N-말단의 PH domain은 전형적인 PH domain의 구조를 갖고 있으나, 지질결합부위 주위의 아미노산 구성이 결합 가능한 지질을 제한 할 것으로 보인다. α-나선이 풍부한 이후 domain은 지금껏 알려지지 않은 새로운 접힘 구조를 갖고 있는 것으로 나타났다. 전체적인 MINERVA9–553의 구조로 원형질 막과의 상호작용을 추정할 수 있으며, C-말단의 유연 부위이 이 상호작용을 조절할 것으로 보인다. MINERVA9–553 의 구조를 밝힘으로써 새로운 단백질 접힘 구조를 발견하였으나, 동시에 C-말단 유연 부위의 PH domain에 대한 자기조절작용 기제의 규명 과제 또한 제시한다.Chapter 1. Introduction 1 1.1. Study Background 1 1.2. Purpose of Research 13 Chapter 2. Materials and methods 14 2.1. Cloning, expression, and purification of MINERVA constructs 14 2.2. Trypsin digestion of MINERVA constructs 25 2.3. Crystallization, data collection and structure determination of MINERVA constructs 28 2.4. Lipid dot blot assay 33 2.5. Cloning, expression, purification, and crystallization of H-Ras1166 34 2.6. Cloning, expression, purification, and crystallization of Keap1321609 39 Chapter 3. Results 42 3.1. Literature search and data mining 42 3.2. Trypsin digestion is essential for producing diffraction quality crystals 46 3.3. Overall structure of MINERVA 56 3.4. PH domain of MINERVA recognizes phosphatidic acid and inositol phosphates 64 3.5. The C-terminal region of MINERVA interacts with Keap1 70 Chapter 4. Discussion 72 Bibliography 75 국문 초록 79 Acknowledgements 80Docto