나트륨/포도당 공동수송체2 억제제와 글루카곤양펩타이드1 수용체 효현제가 당뇨병 동물 모델에서 대사 지표에 미치는 영향

학위논문(박사)--서울대학교 대학원 :의과대학 의학과,2020. 2. 최성희.서론: 심혈관 질환은 제 2형 당뇨병 환자의 주요 사망원인이다. 나트륨-포도당 공동수송체 2 억제제는 신장에서 포도당의 재흡수를 억제하여 혈당을 낮추는 기전으로 작용하는 새로운 계열의 항당뇨병 약제이다. 이는 글루카곤양펩타이드1 수용체 효현제와 몇몇 유사점을 가지고 있다. 두 약제는 공통적으로 혈당 강하, 체중감량을 통해 심혈관 질환 사망률 및 이환률을 감소시킨다. 본 연구에서는 나트륨-포도당 공동수송체 2 억제제인 엠파글리플로진과 글루카곤양펩타이드1 수용체 효현제인 릭시세나타이드가 제 2형 당뇨병 동물 모델에서 미치는 영향을 비교해보고자 한다. 방법: 제 2형 당뇨병 모델인 OLETF rat에서 엠파글리플로진 (3 mg/kg/day, 12주간 경구 투여, n=4) 및 릭시세나타이드 (10 µg/kg/day, 12주간 복강내 투여, n=4)를 처리한 군과 OLETF control (n=3) 및 LETO control (n=3) 을 대상으로 실험을 진행하였다. 모든 군은 12주간의 약물 처치가 끝나가는 시점에 심장초음파검사를 통해 심기능을 측정하였다. 안락사 후, 심장 근육, 대동맥, 지방조직을 채취하여, 심장 조직 및 지방 조직의 조직학적 분석을 시행하였다. 심장 조직 및 지방 조직에서 중성지방 축적 및 지질분해 정도를 측정하였다. 또한 qPCR 을 이용하여 산화 스트레스 관련 유전자 - BAX, Casp3, SOD1, SOD2, NOX4, GPX1, GPX3, XBP1, and CHOP, 미토콘드리아 기능과 관련된 유전자 - COX2, DRP1, MFN1, Cytc, NRF2, TFAM, ATPsyn, and FIS1, 케톤 분해와 관련된 유전자 – MCT1, BDH1, SCOT, 지방산 산화와 관련된 유전자– PGC1α, CPT1α, CPT1β, and CPT2, 염증반응과 관련된 유전자 - ICAM, VCAM, IL-1β, NLRP3, IL-6, TNFα, MMP9, MCP1, p65, IL-8, IL-18, and HO-1, 지방분해 효소와 관련된 유전자 - G0s2-1, G-S2-2, CGI58-1, CGI58-2, CGI58-3, ATGL(Adipose triglyceride lipase)1, ATGL2, ATGL3, HSL(hormone sensitive lipase)1, HSL2, and HSL3들의 발현 양상을 확인하였다. 염증반응의 지표를 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 시행하였다. 결과: 12주간의 약제처리 기간 동안 OL-E 및 OL-G군의 체중은 OL-C 군에 비해 감소하였다. 약제처리 6주 및 12주 시점에서 OL-E 군과 OL-G 군 사이에 체중의 유의한 차이는 없었다. 비공복상태 혈당은 OL-E 군에서 OL-C 군에 비해 유의하게 낮았으나 OL-G와 OL-C 군 사이에는 의미 있는 차이가 없었다. 복강내당부하검사 결과 당부하 후 30분~120분 사이의 혈당은 OL-E 및 OL-G 군에서 OL-C 군에 비해 유의하게 낮았다. 중성지방과 유리지방산 농도는 LT 군에 비해 OL-C 군에서 유의하게 높았으며, 이는 empagliflozin 및 lixisenatide 투여에 의해 감소되는 경향을 보였다. 심장초음파검사에서 E/A는 LT군에 비해 OL-C 군에서 유의하게 낮았다. 그러나, OL-E, OL-G군의 E/A는 OL-C군에 비해 유의한 차이를 나타내지 않았다. 대동맥 혈관에서 Oil red O staining 을 하였으나, 육안적 검사 및 현미경적 검사 모두에서 모든 군에서 동맥경화 플라크는 관찰되지 않았다. 조직학적 검사에서 심장 조직에서는 네 군간에 세포내 지방 축적, 간질 섬유화, 대식세포 침윤 등의 차이를 관찰할 수 없었다. 반면에 지방조직에서는 OL-C군에 비해 OL-E 및 OL-G 군에서 crown like structure 이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 지방세포의 크기를 측정하였을 때, OL-C 군에 비해 나트륨-포도당 공동수송체 2 억제제 처리군에서 지방세포의 크기가 크고, 글루카곤양펩타이드1 수용체 효현제 처리군에서 지방세포의 크기가 작은 것을 확인할 수 있었다. OL-E군에서는 심근 조직 및 지방 조직 모두에서 중성지방 축적이나, 지질분해, 지방산 산화, 산화스트레스, 미토콘드리아 기능, 케톤분해 및 염증관련 유전자들의 발현에 의미 있는 차이가 없었다. OL-G군에서는 지방조직에서 염증 감소와 지방세포 크기 감소가 관찰되었다. 지방분해효소, 지방산 산화, 산화스트레스, 미토콘드리아 기능, 케톤분해 및 염증관련 유전자들의 발현이 지방 조직에서 감소되어 있었다. 반면 심근 조직에서는 지방분해 및 염증관련 유전자들이 항진되어 있는 것이 관찰되었다. 결론: 글루카곤양펩타이드1 수용체 효현제는 산화스트레스, 미토콘드리아, 염증관련 경로를 통해 주로 지방조직에 영향을 주는 것으로 생각된다. 반면 나트륨-포도당 공동수송체 2 억제제는 글루카곤양펩타이드1 수용체 효현제에 비해 심장 및 지방조직에서의 효과는 적은 것으로 보인다. 나트륨-포도당 공동수송체 2 억제제의 경우 본 연구에 포함되지 않은 다른 분자적 경로를 통해 작용을 하거나, 심장 또는 지방 외의 다른 조직에 대한 효과를 통해 심혈관 질환 예방 효과를 보일 가능성이 있을 것으로 사료된다.Introduction: Cardiovascular disease (CVD) is a major cause of death in type 2 diabetes. Sodium-glucose cotransporter 2 (SGLT2) inhibitors are novel class of drugs that inhibit the renal absorption of glucose, and thus, lower blood glucose levels and share similarities with glucagon-like peptide-1 receptor agonists (GLP-1RA) as both reduce cardiovascular morbidity and mortality by lowering through blood glucose levels and causing body weight loss. We compared the effects of empagliflozin (SGLT2 inhibitor) and lixisenatide (GLP-1RA) in type 2 diabetic animal models. Materials and Methods: Empagliflozin (3 mg/kg/day for 12 weeks, the OL-E group, p.o., n=4), lixisenatide (10 μg/kg/day for 12 weeks, the OL-G group, intraperitoneally, n=4), or vehicle (the OL-C group, n=3) were administered to Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) rats (an animal model of T2DM). Long-Evans Tokushima Otsuka (LETO) rats (the LT group, n=3) were used as non-T2DM controls. All rats underwent echocardiography using the Vivid Q ultrasound system to assess cardiac function at the end of the 12-week treatment period, when after euthanasia, hearts, aortic arches and adipose tissues were removed. Hearts and adipose tissues were subjected to histology. Triglyceride (TG) accumulation and lipolysis were measured in cardiac and white adipose tissues, which were also analyzed by qPCR for the expressions of oxidative stress related genes (BAX, Casp3, SOD1, SOD2, NOX4, GPX1, GPX3, XBP1, and CHOP), mitochondria related genes (COX2, DRP1, MFN1, CytC, NRF2, TFAM, ATPsyn, and FIS1), ketolysis related genes (MCT1, BDH1 and SCOT), fatty acid oxidation related genes (PGC1α, CPT1α, CPT1β, and CPT2), inflammation related genes (ICAM, VCAM, IL-1β, NLRP3, IL-6, TNFα, MMP9, MCP1, p65, IL-8, IL-18, and HO-1), and lipase related genes (G0s2-1, G0s2-2, CGI58-1, CGI58-2, CGI58-3, ATGL1, ATGL2, ATGL3, HSL1, HSL2, and HSL3). Western blot analysis was conducted to determine levels of pro-inflammatory markers. Results: During the 12-week treatment period, body weights reduced in the OL-E and OL-G groups as compared with the OL-C group. No significant body weight difference was observed between the OL‐E and OL‐G groups after treatment for 6 or 12 weeks. Non-fasting blood glucose levels in the OL‐E group were significantly lower than in the OL-C, however the non-fasting blood glucose levels were not significantly different between OL-G and OL-C groups. Intraperitoneal glucose tolerance test results after 12 weeks of treatment showed that glucose values from 30 to 120 minutes after glucose loading were significantly lower in the OL‐E and OL-G groups than in the OL-C group. TG and free fatty acid levels which were significantly higher in the OL-C group than in the LT group, were suppressed by the treatment of empagliflozin and lixisenatide. In the echocardiographic examination, E/A was significantly decreased in the OL-C group than in the LT group. E/As in OL-E and OL-G group were not significantly different from that in OL-C group. Oil red O staining of thoracic aortas failed to detect any gross and microscopic atherosclerotic plaque in all group, and the histological examination did not detect any intergroup difference in terms of intracellular lipid droplet, interstitial fibrosis and macrophage infiltration in cardiac tissues. On the other hand, in adipose tissues, numbers of crown-like structures were significantly less in the OL-E and OL-G groups than in the OL-C group. Interestingly, adipocyte size was greater in the OL-E group and less in OL-G group compared to those of the OL-C group. In OL-E group, no significant changes were observed in terms of triglyceride accumulation, lipolysis and expressions of fatty acid oxidation-, oxidative stress-, mitochondrial function-, ketolysis- and inflammation-related genes in cardiac and adipose tissue. In OL-G group, decreased inflammation in adipose tissue and adipocyte size were observed. Expressions of lipase-, fatty acid oxidation-, oxidative stress-, mitochondrial function-, ketolysis- and inflammation-related genes were decreased in adipose tissue. On the other hand, lipolysis and inflammatory pathway were up-regulated in cardiac tissue in OL-G group. Conclusions: GLP-1RAs is considered to act mainly in adipose tissue via oxidative stress, mitochondrial function and inflammation related pathway. On the other hand, SGLT2 inhibitor had less effect on cardiac and adipose tissue than GLP-1RA. Empagliflozin may exhibit cardiovascular protective effect through different molecular mechanisms or effects on other tissues than those found in our study.Introduction 1 Materials and Methods 3 Experimental animals 3 Biochemical measurements 3 Echocardiographic studies 4 Histology examination 4 Triglyceride and lipolysis measurement 5 Real‐time polymerase chain reaction (PCR) quantification5 Western blot analysis 8 Statistical analysis 8 Results 9 Effects of empagliflozin and lixisenatide on body weight and glucose tolerance in OLETF rats 9 Effects of empagliflozin and lixisenatide on biochemical parameters 11 Cardiac Structure and Function 12 Oil-Red O staining of aortas16 Histologic analysis 18 Tissue triglyceride accumulation and lipolysis and related gene expressions 28 Oxidative stress and mitochondria related gene expressions 32 Inflammasome pathway related gene expressions 35 Ketolysis and inflammation related gene expressions 37 Western blotting of pro-inflammatory markers 40 Discussion 43 References 55 Abstract (Korean) 64Docto