TIF1γ restoring vector 를 이용한 간 섬유화 유전자 치료 전략에 관한 연구.

학위논문(석사)--서울대학교 대학원 :융합과학기술대학원 분자의학 및 바이오제약학과,2019. 8. 김효수.간 섬유화는 간 손상에 대한 반응으로 extracellular matrix (ECM) 단백질이 초과로 쌓이는 현상입니다. 간 성상 세포는 간 섬유화 과정 중 활성화 되어 myofibroblast 로 분화되고, 간을 경화 시키는데 핵심 역할을 하는 세포 군으로 잘 알려져 있습니다. 활성화된 간 성상 세포는 myofibroblast marker 인 alpha smooth muscle actin (αSMA) 을 발현하며 collagen과 같은 ECM 단백질을 분비하여 간을 경화 시키는데 기여합니다. 저희 팀은 이전 연구에서 새로운 간 섬유화 기전을 밝혔습니다. 간이 정상인 상태에서는 간 성상 세포 내 transcriptional intermediary factor 1 gamma (TIF1γ) 라는 항 섬유화 인자가 αSMA 발현을 막아 비활성 상태를 유지하고 있습니다. 하지만 간 섬유화 과정에서는 TGFβ1 에 의해 TIF1γ 발현양이 감소하게 되고 그로 인해 억제되고 있던 αSMA발현양이 증가하게 됨으로써 간 성상 세포가 활성화 됩니다. 활성화 된 간 성상 세포는 collagen 과 같은 ECM 단백질을 초과 생성하게 되고, 결국에 간 섬유화가 진행됩니다. 저는 이전 연구에서 밝힌 간 섬유화 기전을 바탕으로 활성화 된 간 성상 세포 내에 낮아진 TIF1γ 발현을 다시 회복시켜준다면 간 성상 세포의 활성화가 억제되고, 그 결과로 간 섬유화가 완화될 것이라고 생각하였습니다. 간 성상세포에서 TIF1γ 발현을 회복시키기 위하여 TGFβ promotor-TIF1γvector (pTGFβ-TIF1γ)를 제작하였습니다. 그리고 in vitro에서 pTGFβ-TIF1γ가 TGFβ에 의해 증가한 αSMA (활성화된 간 성상세포 표지자) 를 감소 시키는 것을 사람의 간 성상 세포주인 LX2에서 확인하였습니다. 이 후 pTGFβ-TIF1γ의 간 섬유화 완화 효과를 in vivo에서 확인하고자 하였습니다. 그 전에 vector 를 간 성상 세포에 특이적으로 전달하는 도구로 Vit A-coupled liposome 을 채택하였고, 간 성상 세포에 특이적으로 vector 를 전달하는 것을 in vivo 실험에서 확인하였습니다. 그 후 TAA(Thioacetamide) 간 섬유화 동물 모델에서pTGFβ-TIF1γ의 섬유화 완화 효과를 확인하였습니다. 이러한 결과를 통해 저는 간 섬유화 과정 중 간 성상 세포 내 항 섬유화 유전자 TIF1γ의 중요성 및 pTGFβ-TIF1γ의 간 섬유화 완화 효과를 확인 할 수 있었습니다. 저는 이 연구가 간 섬유화 유전자 치료의 가능성을 확인 시켜주었다고 생각합니다.Liver fibrosis is a phenomenon of excessive accumulation of extracellular matrix (ECM) proteins in response to liver damage. Hepatic stellate cells (HSCs) are known to be a group of cells that are activated during liver fibrosis and differentiate into myofibroblasts and play a key role in liver fibrosis. Activated HSCs express alpha smooth muscle actin (αSMA), a myofibroblast marker, secrete ECM proteins such as collagen. Our team identified a new mechanism of liver fibrosis in previous studies. In normal liver, an anti-fibrotic factor called transcriptional intermediary factor 1 gamma (TIF1γ) suppresses αSMA expression to inactivate in HSCs. However, during liver fibrosis, TGF(transforming growth factor)β1 decreases TIF1γ expression and increases αSMA expression, which activate HSCs. Activated HSCs overexpresses ECM proteins such as collagen and eventually causes liver fibrosis. My hypothesis is that restoring the lowered TIF1γ expression of activated HSCs would inhibit HSCs activation and result in liver fibrosis mitigation. The TGFβ promoter-TIF1γ vector (pTGFβ-TIF1γ) was constructed to restore TIF1γ expression in activated HSCs. In vitro experiments were conducted using LX2, human HSCs cell line. As a result, αSMA, activated HSCs marker was reduced when the pTGFβ-TIF1γ vector was transfected. Next, I tried to confirm the effect of pTGFβ-TIF1γ on liver fibrosis in vivo. Before that, I used VitA-coupled liposome as a tool to deliver vectors specifically to HSCs and confirmed that VitA-coupled liposome transferred vectors specifically to HSCs. And I confirmed the fibrosis mitigation effect of pTGFβ-TIF1γ in liver fibrosis model with thioacetamide (TAA). These results showed the importance of TIF1γ in the HSCs as anti-fibrotic factor and the mitigation effect of pTGFβ-TIF1γ on liver fibrosis. I think this study verified the possibility of liver fibrosis gene therapy.CONTENTS Introduction 1 Material and Methods 4 Results 11 Discussion 32 Reference 35 Abstract in Korean 37Maste