Isolation, Characterization and Pathogenesis of Bartonella grahamii in Korea

Bartonella는 Alphaproteobacteria 강, proteobacteria 과에 속하는 그람 음성 간상균이다. 이 세포내 기생균은 적혈구와 내피세포에 쉽게 감염하며, 그 중 10종(B. henselae, B. koehlerae, B. elizabethae, B. grahamii, B. clarridgeiae, B. vinsonii subsp. arupensis, B. vinsonii subsp. berkhofii, B. tamiae, B. rochalimae, B. washoensis)은 인수공통 전염병의 원인체로 알려져 있다. 이들 중 B. grahamii는 한국을 비롯한 아시아 주변 국가에서 28개의 Bartonella species 중 가장 높은 빈도로 검출되고 있으며, 사람에서 시신경망막염의 원인체로 보고되어있다. 본 논문의 첫 번째 연구에서는, 야생 고라니 (Korean water deer, Hydropotes inermis argyropus)와 등줄쥐 (Striped field mouse, Apodemus agrarius)의 비장에서 감염율을 조사하였으며, 두 번째 연구에서는, 두 개의 B. grahamii 균주(KRBG28와 KRBG32)를 야생 등줄쥐의 혈액으로부터 분리하여 형태학적, 분자생물학적 및 단백질 성분 분석을 통하여 특성을 규명하였다. 세번째 연구에서는 앞서 분리된 KRBG28과 KRBG32의 병원성을 in vitro와 in vivo 연구를 통하여 평가하였다. 첫 번째 실험에서는 고라니와 등줄쥐에서 Bartonella의 감염율과 Bartonella 종별 감염 빈도를 조사하기 위하여, 70개의 고라니 비장과 200개의 등줄쥐 비장에서 RNA polymerase subunit beta(rpoB)와 16S-23S intergenic spacer(ITS) 유전자를 검출하는 중합 효소 연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 실시하였다. 총 70마리의 고라니 비장 중 11개체(15.8%)의 비장에서 B. grahamii, 9마리(12.9%)의 비장에서는 B. schoenbuchensis ITS 유전자가 각각 검출되었다. 이중 검출된 11개의 B. grahamii ITS 유전자는 염기서열 분석을 통하여 2개의 유전자형으로 분류되었다. 200마리의 등줄쥐 비장에서는 62.0%의 개체에서 Bartonella의 ITS 유전자가 확인되었으며, rpoB 유전자는 31.5%의 등줄쥐 비장에서 검출되었다. 검출된 ITS와 rpoB 유전자는 염기서열 비교 분석을 통하여 29개의 유전자형으로 정리되었다. 그 중 등줄쥐에서 가장 높은 빈도로 검출된 B. grahamii는 17개의 유전자형이 확인되었다. 인수공통병원체인 B. taylorii(rpoB: 97.0~98.0%,ITS: 67.1~93.8%), B. tribocorum(rpoB: 95.6%,ITS: 83.0%), B. henselae(rpoB: 100%, ITS: 98.2~98.5%)종과 염기서열이 유사한 유전자형들 또한 등줄쥐에서 확인되었다. 본 연구를 통하여 야생 고라니에서 B. grahamii와 B. schoenbuchensis의 자연감염을 처음 확인함으로써 고라니가 Bartonella의 보균체 역할을 가질 가능성을 제시하였다. 두 번째 실험에서는 등줄쥐 혈액에서 분리된 2개의 Bartonella 균주(KRBG28와 KRBG32)에서 16S rRNA, hemin-binding protein E(hbpE), glutamate dehydrogenase 1(gdh 1), invasion associated protein B (ialB), cell division protein(ftsZ), citrate synthase(gltA), 60 KDa heat shock protein(groEL), rpoB, ITS 유전자 염기서열의 비교, 분석을 통하여 분리주를 B. grahamii 종으로 동정하였다. 통합된 5개의 유전자 (16S rRNA, ftsZ, gltA, groEL and rpoB) 염기서열을 계통발생학적으로 분석(MLSA, Multi locus sequence analysis)한 결과 KRBG28와 KRBG32는 유럽/미국형 B. grahamii 유전자군과 일본과 중국을 주 대상으로 하는 동북 아시아형 B. grahamii 유전자군 사이에 독립적인 계통을 구성하였다. 나아가 본 연구에서는 KRBG28, KRBG32와 B. grahamii 표준균주(V2, ATCC700132)간의 단백질성분을 2차원 전기영동(2D, 2-dimentional analysis) 방법으로 비교, 분석하였다. 각 균주간 발현양이 다르거나 한 균주에서만 발현되는 단백질 중 총 86개의 단백질을 선별하여 단백질 분관분석법(MALDI, Matrix-assisted laser desorption/ionization)을 통하여 동정하였다. KRBG28, KRBG32와 표준균주간 발현양이 2배 이상 차이를 보이는 38개의 단백질과 KRBG28, KRBG32나 표준 균주에서만 독립적으로 발현하는 48개의 단백질을 동정하여 Clusters of Orthologus Groups(COGs) 분석법을 이용하여 다음의 4가지 기능으로 분류하였다: (1) 세포 내 정보저장과 처리 (2) 세포 공정 및 신호전달 (3) 대사 (4) 기타. 동정된 단백질들은 세포 환경적 정보 처리, 세포 대사, 세균의 항생제 내성, 유전자 복구 등의 기능을 가지며, 세균의 병원성에 직•간접적인 역할을 수행하는 것으로 분석되었다. 본 연구를 통하여 국내 최초로 B. grahamii를 분리, 동정 하였으며, 분리주의 특성 분석 결과는 의학적으로 중요성이 부각되고 있는 B. grahamii의 병원성 연구에 가치있는 자료로서 이용될 수 있다. 세 번째 실험에서는, 사람의 혈관내피세포를 이용한 in vitro 연구와, C57BL/6 생쥐를 이용한 in vivo 실험을 통하여 KRBG28와 KRBG32의 병원성을 표준균주와 비교, 평가하였다. 숙주의 내피조직은 Bartonella가 감염되는 주요 표적 구조물이며 질병을 유발하는 기시점이다. 따라서 in vitro 실험에서는 B. grahamii와 사람 혈관내피세포와의 상호작용과 병원성에 관계되는 세포의 신호 전달 체계를 평가하였다. KRBG28와 KRBG32는 혈관내피세포 감염 후 12 시간 이내에 B. henselae의 세포 침입과 관련된 독특한 구조물인 invasome을 형성하며 내피세포에 침투하였다. 반면 표준균주는 invasome을 형성하지 않고, 세포에 의해 탐식되어 핵주변에 위치한 포식소체에 위치하였다. KRBG28와 KRBG32의 경우 세포침투와 동시에 nuclear factor-κB(NF-κB)를 활성화시켜 염증관련 부착인자인 intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1)과 E-selectin의 발현이 감염 후 4시간 이내에 유의성 있게(P<0.001) 증가하는 것을 실시간 중합효소연쇄반응과 western blot 분석을 통하여 확인하였다. 이러한 현상은 염증 매개 사이토카인인 interleukin(IL)-6, IL-8과 monocyte chemotactic protein-1(MCP-1)등의 발현증가와 함께 관찰되었다. 반면, 표준균주는 NF-κB의 활성을 증가시키지 않은 채 감염 18시간 후 세포의 MCP-1의 분비를 촉진시켰다. 위의 결과로 보아 한국 분리주는 표준균주와 비교하여 혈관내피세포의 강력한 염증 반응을 야기하는 것으로 보인다. 기존 보고에 따르면 Bartonella는 내피세포 감염 시 mitogen-activated protein kinase(MAPK) 경로를 활성화 시키고, cellular inhibitor of apoptosis(cIAP)의 발현을 증가시켜 세포의 자연사를 방해하여 세포의 증식을 촉진하는 것으로 잘 알려져 있다. 하지만 KRBG28와 KRBG32의 경우 extracellular signal-regulated kinase(ERK1/2), c-Jun N-terminal kinase(JNK), p38, AKT 단백질의 인산화를 저해하고 세포 자연사의 내재적 경로와 관련된 B-cell lymphoma 2(Bcl-2), B-cell lymphoma-extra large(Bcl-xl), Bim 등의 발현을 억제하며, 강력한 세포사 유도 경로인 Fas-caspase-8 경로를 활성화하여 내피세포의 자연사를 유도하였으며(KRBG28: 49.3±6.3%, KRBG32: 79.1±2.6%). 이를 유세포 분석기(flow cytometry, FACS)와 공초점 형광 현미경(confocal)을 통하여 확인하였다. 이와는 반대로 표준균주는 내피세포의 자연사를 거의 유도하지 않았으며(표준균주: 27.9±2.9%, 대조군: 13.9±1.8%). 오히며 Bcl-2와 Bcl-xl의 발현을 증가시켰다. KRBG28와 KRBG32에 의한 내피세포 자연사 유도는 기존의 보고와는 상반된 새로운 결과이다. 한국분리주의 병원성을 in vivo 실험을 통하여 평가하고자, KRBG28 투여군(15마리), KRBG32 투여군(15마리), 표준균주 투여군(15마리)과 생리식염수 투여군(15마리), 총 4개의 실험군, 60마리의 C57BL/6 생쥐에 투여 후 2, 4, 6 주에 생쥐를 희생하여 부검하였다. 감염된 생쥐의 혈액, 심장, 폐, 간, 신장, 비장에서 B. grahamii 유전자가 검출되었다. KRBG28와 KRBG32에 감염된 생쥐의 조직 병리학적 소견에서 심근염, 섬유화를 동반한 육아종 간염과 신장염, 조직 괴사를 동반한 혈관 주위염 소견이 관찰되었다. 반면 표준균주 투여군에서는 간과 신장의 국소 괴사를 동반한 염증 세포 침윤과 신장의 육아종성 괴사 소견이 관찰되었다.조직학적 분석 소견을 통하여 KRBG28와 KRBG32가 표준균주에 비하여 강한 병원성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과는 설치류 유래의 B. grahamii가 다른 숙주에 감염하였을 때 병원성을 보일 수 있는 가능성을 제시하고 있다. KRBG28와 KRBG32에 의하여 유발하는 염증성 병변과 관련된 사이토카인의 연관성을 분석하기 위하여 interferon-γ(IFN-γ), tumor necrosis factor-α(TNF-α), IL-2, IL-4, IL-5의 혈중 농도를 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용하여 측정하였다. IFN-γ의 경우, 감염 2주 후 유의성 있게(0.001<P)증가하였다가 4주 이후 정상치로 회복되었다. 하지만 TNF-α(P<0.001), IL-2(P<0.05), IL-4(P<0.05), IL-5(P<0.001)의 경우는 감염 6주 이후 유의성 있게 증가되는 경향을 보였다. 결과적으로, B. grahamii는 생쥐 감염 시 면역 세포를 자극하여 TNF-α와 IFN-γ의 분비를 촉진하여 염증반응을 유발하는 것으로 보인다. 결론적으로, 고라니에서 Bartonella를 검출함으로서 보균체로서의 가능성을 제시하였으며, B. grahamii가 한국 설치류에 높은 빈도(65.0%)로 감염되어 있음을 확인하였다. 또한 KRBG28와 KRBG32를 분리하여 특성 및 병원성을 평가한 결과 표준균주보다 강한 병원성을 보이는 것으로 확인되었다. 앞으로 Bartonella의 종별 숙주 특이성, 감염성 및 잠재적 숙주에게 입힐 수 있는 병원성과 공중보건학적 영향 등을 밝히기 위한 지속적인 연구가 요구된다.Bartonella is gram negative, pleomorphic bacilli in the class Alphaproteobacteria, family proteobacteria. This obligate intracellular bacteria commonly infects erythrocytes and endothelial cells and is transmitted by arthropod vectors or by animal scratches or bites. Currently, twenty-eight species or subspecies of Bartonella have been characterized, of which ten species were reported as zoonotic pathogens. Bartonella grahamii, reported as a causative agent of human neuroretinitis, is predominant species distributed in Asian countries, including Republic of Korea (ROK). This study is composed of three parts. In the first experiment, in order to determine the prevalence of Bartonella species and investigate which species of Bartonella naturally infect Korean water deer (KWD, Hydropotes inermis argyropus) in ROK, it was analyzed that spleens of 70 KWD and 200 striped field mouse (SFM, Apodemus agrarius) by nested PCR targeting RNA polymerase subunit beta (rpoB) gene and 16S-23S intergenic spacer (ITS) region of genus Bartonella. Using ITS-based nested PCR, B. grahamii and B. schoenbuchensis were detected in 11 (15.8%) and 9 (12.9%) of 70 KWD spleens, respectively. By rpoB-based nested PCR, B. grahamii was detected in 6 (8.6%) of 70 KWD spleen samples. The prevalence of Bartonella species, in SFM spleen samples, was 62.0% (124/200) by ITS region detecting PCR and 31.5% (63/200) by rpoB targeting analysis. The most prevalent species in SFM were B. grahamii which were assigned to 17 GTs. Genotypes close to the zoonotic B. taylorii, B. tribocorum and B. henselae were also detected. This is the first report on detection of B. grahamii and B. schoenbuchensis in KWD, suggesting that they may act as reservoirs for bartonellosis zoonotic pathogens. In the second experiment, a total of 2 Bartonella isolates (KRBG28 and KRBG32) were recovered from the blood of SFM, captured in ROK and were characterized using morphologic, genotypic and proteomic methods. Comparison of 16S rRNA, hemin-binding protein E (hbpE), glutamate dehydrogenase 1 (gdh 1), invasion associated protein B (ialB), cell division protein (ftsZ), citrate synthase (gltA), 60 KDa heat shock protein (groEL), and rpoB gene and ITS region sequences from the isolates indicated that they were identified as B. grahamii. Phylogenetic analysis based on alignment of concatenated sequences (4,933 bp) of KRBG28 and KRBG32 were clustered into B. grahamii, forming an independent clade between Asian and American/Euripean B. grahamii genogroups. This study characterized differential protein expression profiles among Korean B. grahamii isolates, KRBG28 and KRBG32, and lab strain V2. Among the differentially expressed proteins, 86 proteins were identified; 38 proteins had a minimum two-fold change in expression level and 48 proteins were expressed only in either Korean isolates (KRBG28 and KRBG32) or lab strain V2 (ATCC700132). The proteins up-regulated or expressed only in Korean isolates B. grahamii are associated with processing environmental information, metabolism, bacterial antibiotic resistance and gene repair, and most of these proteins are known to have a role in pathogenicity of bacterium. These proteomics results provide novel insight into pathogeneicity and associated putative virulence factors of B. grahamii of increasing medical importance. In third experiment, to evaluate and compare the pathogenic capacity among KRBG28, KRBG32 and lab strain V2, in vitro and in vivo analysis was carried out using human vascular endothelial cells (HUVECs) and immunocompetent C57BL/6 mice. Within 12 h, KRBG28 and KRBG32 adhere and invade HUVEC, forming an invasome which is typical membrane binding structure of B. henselae. However, lab strain V2 showed uptake of bacterium into perinuclear localizing phagosome. In addition, KRBG28 and KRBG32 strongly stimulated HUVEC, as determined by nuclear factor-κB (NF-κB) activation and enhanced inflammatory adhesion molecules. KRBG28 and KRBG32 were much more active in inducing inflammatory response of HUVEC than the typing strain B. grahamii V2. Bartonella have been known to inhibit apoptosis of HUVEC by activating mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway and increasing cellular inhibitor of apoptosis (cIAP). Interestingly, KRBG28 and KRBG32 triggered HUVEC death in 24 h after stimulation and this effect was accompanied by reduction of selected protein kinase signaling (ERK1/2, JNK, p38 and AKT pathways), regulation of Bcl-2 family genes (Bcl-2, Bcl-xl and Bim) and activation of Fas pathway (Fas, caspase-8 and caspase-3). In contrast, B. grahamii lab strain V2 has not induced apoptosis and following regulation of apoptosis related proteins. To determine their relative pathogenicity in inducing manifestations of diseases, four groups of 15 C57BL/6 mice were each inoculate with 108 colony forming unit (CFU) of 1 of 3 B. grahamii strains/isolates (V2, KRBG28 and KRBG32). Histopathological changes were observed in tissues of inoculated mice, and severity of lesions correlated with the isolate inoculated, with the most severe pathology induced by Korean B. grahamii isolates KRBG28 and KRBG32. Mice inoculated with KRBG28 and KRBG32 demonstrated myocarditis, perivasculitis associated vascular necrosis, and granulomatous hepatitis and nephritis with associated hepatocellular and renal necrosis. Mice inoculated with V2 developed an inflammatory cell infiltration at liver and kidney, and granulomas within the kidneys. To determine the role of pro-inflammatory cytokines, levels of interferon-γ (IFN-γ), tumor necrosis factor-α (TNF-α), IL-2, IL-4 and IL-5 were analyzed in inoculated mice serum using ELISA. Serum level of IFN-γ (P<0.001) was significantly increased at 2 weeks after B. grahamii inoculation, whereas returned to control value at 6 weeks after stimulation. In contrast, levels of TNF-α (P<0.001), IL-2 (P<0.05), IL-4 (P<0.05) and IL-5 (P