치은상피세포에서 Treponema denticola가 IL-8 발현을 억제하는 기전

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 치의과학과, 2012. 2. 최영님.1. 목적 치주염은 세계 성인 80%가 적어도 하나 이상의 치아에서 앓고 있는 고빈도 구강질환이다. 소위 'Red compex'로 분류되는 세균은 치주염과 높은 연관성이 있고 치주 병원균으로 간주된다. Red complex에 속하는 세균은 Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola로 구성되어진다. 접합상피가 발현하는 IL-8의 매개로 치은열구로 이동한 호중구는 치주건강을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 배양접시에서 Red compex에 속하는 세균은 치은상피세포로부터 IL-8의 분비를 억제하는 것을 확인하였다. 본 연구에서는 치은상피세포에서 그 억제효과가 가장 큰 것으로 관찰된 T. denticola에 의한 IL-8 억제기전을 알아보고자 한다. 2. 실험방법 치은상피세포에 원형의 T. denticola (WT), 단백질 분해효소인 dentilisin이 없는 변이주 T. denticola (K1) 또는 편모를 형성하는 고리가 없는 변이주인 T. denticola (flgE)를 2% 사람 혈청이 없거나 또는 있는 상태에서 24시간 감염시킨 후 역전사 중합효소연쇄반응 (Real-time RT-PCR)과 효소결합면역분석법 (ELISA)를 이용하여 IL-8, TNFα 발현 양상을 확인하였다. IL-8의 발현이 T. denticola의 치은상피세포의 침투능력에 따라 달라지는 것인지 알아보기 위해 세균의 상피세포 침투를 유세포 분석법을 이용해 관찰하였다. 또한 T. denticola에 의한 케모카인과 싸이토카인 분해 능력을 관찰하기위해 IL-8, TNFα, IL-1α를 함유한 치은상피세포 배양액에 T. denticola를 24시간 배양한 후 효소결합면역분석법으로 변화를 관찰하였다. 3. 결과 치은상피세포에 WT, K1, flgE T. denticola를 감염시킨 후 효소면역결합분석법의 결과를 보면 WT와 flgE은 IL-8 단백질을 감소시켰으나 K1은 억제하지 못했다. 이는 단백질분해효소인 dentilisin이 IL-8을 억제하는 한 요인으로 작용한다는 것을 의미한다. 그러나 IL-8 mRNA 발현 양도 단백질 발현 양과 같이 WT와 flgE에 의해 억제되는 것을 관찰하였다. 또한, 2% 사람 혈청을 첨가한 배양조건에서는 K1을 포함한 모든 T. denticola에 의한 IL-8 억제가 심화되었다. 치은상피세포에 침투한 T. denticola가 IL-8 mRNA 발현을 억제한다는 가정 하에 WT, K1, flgE의 치은상피세포 침투능력을 관찰하였으나 차이를 보이지 않았다. 더욱이, 2% 사람 혈청이 있을 때는 세균의 침투능력이 현저히 감소하였다. IL-8의 발현을 유도할 수 있는 염증성 싸이토카인인 TNFα의 단백질과 mRNA 발현 양을 관찰한 결과 IL-8과 유사하게 WT와 flgE만이 단백질과 mRNA 발현 모두를 억제하였다. T. denticola에 의한 케모카인과 싸이토카인 분해 능력을 관찰한 결과 WT와 flgE만이 IL-8와 TNFα을 분해하였고, IL-1α는 영향을 주지 않았다. 이상의 결과는 단백질분해효소인 dentilisin이 IL-8과 TNFα를 파괴하며, 아마도 감소된 TNFα의 작용으로 IL-8의 단백질 뿐 아니라 mRNA의 발현도 억제한다는 것을 제시한다.Objectives: Periodontitis is a prevalent disease that affects at least one tooth in 80% of adults worldwide. A group of bacteria, so called classified as red complex, is highly associated with periodontitis and regarded as periodontal pathogens. The red complex is composed of Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema denticola. IL-8, a chemokine producted by junctional epithelium, mediates the recruitment of neutrophils to the gingival sulcus. The recruited neutrophils play an important role in maintaining periodontal health. It was previously found that red complex bacteria suppressed IL-8 production in gingival epithelial cells. Among them, T. denticola presented the highest suppressive effect. The purpose of this study is to investigate mechanism(s) for IL-8 suppression by T. denticola in gingival epithelial cells. Methods: Immortalized gingival epithelial HOK-16B cells were infected with wild type (WT), dentilisin (one of protease)-deficient (K1), or flagellin-deficient (flgE) T. denticola in the absence or presence of 2% human serum for 24 hours. The levels of IL-8 and TNFα expression were measured by realtime RT-PCR and ELISA. Invasion abilities of WT, K1, and flgE T. denticola were measured by flow cytometry. In addition WT, K1, and flgE T. denticola were incubated in the culture medium of gingival epithelial cells which contained recombinant IL-8, TNFα, and IL-1α, to examine their abilities to degrade these chemokines and cytokines. Results: In the absence of 2% human serum, WT and flgE T. denticola decreased the level of IL-8 protein, but K1 T. denticola did not. This result suggested that the protease, dentilisin, could be responsible for the IL-8 suppression by T. denticola. However, WT and flgE T. denticola also inhibited the expression of IL-8 mRNA. In addition, in the presence of 2% human serum, even K1 T. denticola suppressed the expression of IL-8 mRNA and protein, but less than WT and flgE T. denticola. We hypothesized that the invasion of T. denticola may be required for the inhibition of IL-8 mRNA. Therefore, we examined the invasion abilities of WT, K1, and flgE T. denticola. However, there was no difference in invasion ability among the three strains. Additionally, the invasion ability of T. denticola substantially decreased in the presence of 2% human serum. Because an inflammatory cytokine TNFα is known to induce IL-8 expression, and HOK-16B cells express TNFα at basal level, the level of TNFα protein and mRNA were examined. The results were similar to IL-8. Finally, when the ability of T. denticola to degrade chemokines and cytokines were examined, WT and flgE T. denticola degraded IL-8 and TNFα, but not IL-1α. In conclusion, dentilisin, a protease of T. denticola, not only degrades IL-8 and TNFα proteins but also inhibits the transciption of IL-8 and TNFα, provably via decreasing the level of TNFα.Maste