장 상피세포와 면역세포 공동 배양 모델에서 Fumonisin B1과 그 가수 분해 산물에 의한 염증 반응 비교

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 농업생명과학대학 농생명공학부, 2019. 2. 윤철희.Many fungi are able to produce several types of mycotoxins. Among them, deoxynivalenol (DON) is the most prevalent trichothecene mycotoxin, which is produced by Fusarium species globally. Fumonisin B1 (FB1), mainly produced by Fusarium verticillioides and Fusarium proliferatum, is also abundant in agricultural commodities. Therefore, both humans and animals are often exposed to the toxic effects of multiple mycotoxins, resulting in subclinical symptoms in the gastrointestinal tract. In the present study, the toxic effects of combined DON and FB1 exposure in the intestinal epithelium were examined with a co-culture model using a porcine intestinal epithelial cell line (IPEC-J2) and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from pig blood, with a focus on gut integrity and immune modulation, respectively. First, we confirmed that DON, in the presence of an endotoxin (lipopolysaccharide: LPS), disrupted gut permeability and induced IL-8 production. Furthermore, FB1 induced additional damage to gut barrier function and promoted pro-inflammatory responses in the presence of LPS and DON compared to only LPS/DON treatment. In the co-culture system, FB1/LPS/DON induced increased cell death of PBMCs and pro-inflammatory cytokines than LPS/DON treatment. In contrast, the application of hydrolyzed FB1 (HFB1), the product of enzyme-degraded FB1, resulted in reduced levels of chemokines and pro-inflammatory cytokines together with marginal immune cell death compared to FB1/LPS/DON in the IPEC-J2–PBMC co-culture system. These findings suggest that FB1 aggravates LPS/DON-induced intestinal inflammation, and hydrolyzation of FB1 may be considered as an effective strategy to reduce intestinal inflammation in pigs.곰팡이독소는 곰팡이에서 생산되는 제2차 대사산물로 대부분의 곰팡이들은 여러 가지 곰팡이독소들을 동시에 생산할 수 있으며, 현재까지 완전히 독성이 규명된 곰팡이독소의 수만 600여 개 이상이다. 그 중에서 Deoxynivalenol (DON)은 Fusarium곰팡이 종에서 생산되는 trichothecene 곰팡이독소들 중에서 가장 많이 분석되는 trichothecene 곰팡이독소이다. 또한 Fumonisin B1 (FB1)은 주로 Fusarium verticillioides과 Fusarium proliferatum에서 생산되며 옥수수를 비롯한 대다수의 농산물에서 분석된다. 따라서, 인간뿐만 아니라 가축들도 다양한 곰팡이독소 독성에 노출되어 있으며, 그 중에서도 장관 내에서 나타나는 준 임상증상들과 깊은 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 돼지 장 상피세포 (IPEC-J2)와 돈 혈의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 공동 배양하는 모델을 구축하여 장 상피세포에 DON과 FB1의 독성 효과를 규명하고자 했는데 특히, 장 온전성 (integrity)과 면역력 조절 작용을 중점적으로 살펴보았다. 첫 번째로, endotoxin (Lipopolysaccharides: LPS)과 DON를 함께 처리한 경우 TR (transepithelial electrical resistance) 치로 알아본 결과, 장 투과성 (permeability)이 높아지고 또한 염증성 사이토카인, IL-8의 생산이 높아짐을 알 수 있었다. FB1를 추가로 처리 했을 때는 장 장벽 기능 (gut barrier function)이 유의 차 있게 더 약화되고 염증 반응도 더 심화되는 것을 발견했다. 공동 배양 모델에서, FB1/LPS/DON 처리 구는 LPS/DON 처리구보다 PBMC내에서 더 많은 수의 면역 세포 사멸을 가져왔고, 더 많은 염증성 사이토카인들의 생산을 유도했다. 이와반대로, 효소 작용에 의해 가수 분해된 FB1 (HFB1)은 LPS/DON과 함께 처리 했을때 FB1/LPS/DON 처리 구와 비교해서 더 낮은 염증성 사이토카인들과 체모카인 (chemokine) 생산을 유도했으며, 매우 제한적인 면역세포의 사멸을 나타내었다. 결론적으로, FB1은 LPS/DON으로 유도된 장 염증 작용을 악화시켰으나, 효소 처리에 의한 FB1의 가수분해는 FB1에 의한 돼지 장 내 염증을 완화시키는 데 기여할 수 있음이 증명되었다.Summary I Contents II List of Figures IV List of Tables VI List of Abbreviations VII I. Literature Review 1 1. Mycotoxins 1 1.1. What are mycotoxins 1 1.2. Mycotoxins and their immune modulation in pigs 2 1.3. Mycotoxins and their toxic effects in intestines 3 1.4. Mycotoxins and toxicological interactions 4 2. Host response against mycotoxins 5 2.1. Intestinal epithelial cell and mycotoxins 5 2.2. Effect of mycotoxins on intestinal immune response 6 2.3. Mycotoxins on intestinal barrier integrity 7 3. Detoxification of mycotoxins 10 3.1. Prevention methods 10 3.2. Elimination of mycotoxins 11 3.3. Biological methods: Adsorption and biotransformation 12 II. Introduction 16 III. Materials and Method 18 1) Cell culture 18 2) Mycotoxin and endotoxin treatment 18 3) Measurement of transepithelial electrical resistance 18 4) Western blot analysis 19 5) Porcine peripheral blood cell isolation 19 6) Co-culture IPEC-J2/PBMC 20 7) Real-time PCR 20 8) Enzyme-linked immunosorbent assay 20 9) Flow cytometry 23 10) Annexin V7AAD analysis 23 11) MTT assay 24 12) Statistical analysis 24 IV. Results 24 1) FB1 increased intestinal permeability of porcine intestinal epithelial cells 24 2) Treatment of both FB1 and HFB1 exhibited comparable damage on barrier integrity 26 3) HFB1 induced less inflammatory chemokine expression than FB1 in porcine epithelial cells 28 4) HFB1 resulted in less TNF-α production than FB1 in the IPEC-J2/PBMC co-culture model 32 5) HFB1 caused lower immune cell death than FB1 in the IPEC-J2/PBMC co-culture model 34 V. Supplementary results 36 1) Permeability of IPEC-J2 treated with different solvents 36 2) Experimental scheme for co-culture model and gating strategy for PBMCs 37 3) Change of PBMC subpopulation treated with FB1 and HFB1 in the co-culture model 39 4) Regulatory T cells and cytokine expression in the IPEC-J2/PBMC co-culture model after treatment with FB1 or HFB1 41 VI. Discussion 42 VII. Literature Cited 49 VIII. Summary in Korean 62Docto