항암효과를 가진 새로운 Hsp90 억제재 개발

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 융합과학기술대학원 분자의학 및 바이오제약학과, 2019. 2. 이호영.Lung cancer is one of the leasding causes of death among many types of cancers. More than 85% of lung cancer patients are diagnosed with non-small cell lung cancer (NSCLC) and treated with chemotherapy. Unfortunately, prolonged treatment chemotherapy could caus drug resistance. Despite the development of advanced therapeutic regimens such as molecular targeted therapy and immunotherapy for overcoming drug resistance of chemotherapy, the 5-year survival of patients with lung cancer is still less than 20%, suggesting the need to develop additional treatment strategies. The molecular chaperone heat shock protein 90 (Hsp90) plays important roles in the maturation of oncogenic proteins and thus has been considered as an anticancer therapeutic target. Here we show the efficacy and biological mechanism of Hsp90 inhibitor NCT-50, deguelin analogs. NCT-50 exhibited significant inhibitory effects on the viability and colony formation of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells and those carrying resistance to chemotherapy. In contrast, NCT-50 showed minimal effects on the viability of normal cells but induced apoptosis in NSCLC cells. Interestingly, NCT-50 inhibited the expression and activity of several Hsp90 client proteins including hypoxiainducible factor (HIF)-1α, and suppressed pro-angiogenic effects of NSCLC cells. Further biochemical and in silico studies revealed that NCT-50 downregulated Hsp90 function by interacting with the C-terminal ATPbinding pocket of Hsp90, leading to decrease in the interaction with Hsp90 client proteins. These results suggest the potential of NCT-50 as an anticancer Hsp90 inhibitor.암은 인간의 사망 원인 중 가장 큰 요인으로 알려져 있으며, 그 중 폐암이 가장 높은 사망률을 나타내고 있다. 폐암에서 85%이상이 비소세포 폐암(Non-small cell lung cancer)으로 진단을 받고 항암화학요법 치료를 받는다. 유감스럽게도 항암화학요법(chemotherapy) 치료를 장 기간 받으면 약에 대한 내성이 발생한다. 이런 문제점을 개선하기 위해 분자 표적 항암제(molecular targeted therapy), 면역 항암제가 개발 되고 있지만, 환자 5년 생존율이 여전히 20% 미만이다. 이런 현상은 또 다른 개선된 치료적 전략이 필요하다는 것을 제시한다. 분자적 샤페론 역할을 하는 열충격단백질90(Hsp90)은 발암의 관여하는 단백질들의 성숙에 중요한 역할을 하고 있기 때문에 항암제 치료적 타겟으로써 여겨져 왔다. 우리는 deguelin 유사체인 NCT-50 약의 효능과 열충격단백질90 억제제로써의 생물학적 기전을 보여 준다. NCT-50은 비소세포 폐암 세포 그리고 화학항암제에 내성을 가지고 있는 세포에서 생존 능력과 군집 형성을 현저히 억제하고 세포자멸사를 유도했다. 이에 반해, 정상 세포에서는 최소한 독성을 나타냈다. 흥미롭게도, NCT-50은 열충격단백질90의 클라이언트 단백질인 HIF-1α 발현과 활성을 억제하고 혈관 형성 억제 효과를 보여줬다. 더 나아가 생화학적 그리고 컴퓨터 시물레이션 연구를 통해 NCT-50이 열충격단백질의 C 말단의 ATP 결합 자리에 상호작용하여 열충격단백질90의 기능을 저하시킨다는 것을 밝혔다. NCT-50이 열충격단백질90에 결합함으로써 열충격단백질과 클라이언트 단백질의 결합이 감소한다는 것도 보여줬다. 이러한 결과를 통해, NC5-50이 항암효과를 가진 열충격단백질90 억제재로써 가능성을 가지고 있다는 것을 제시한다.Abstract Table of contents Table Figures 1. Introduction 2. Materials and methods 2.1. Reagents 2.2. Cell culture 2.3. MTT assay 2.4. Anchorage-dependent and anchorage-independent colony formation 2.5. Cell cycle analysis 2.6. Tube formation assay 2.7. Nuclear morphology analysis 2.8. Western blot analysis 2.9. Real-time PCR 2.10. Immunoprecipitation and pull-down assay 2.11. Docking modeling 2.12. Statistical analysis 3. Results 3.1. Screening of NCT-drugs 3.2. NCT-50 significantly inhibits the viability and colony forming ability of NSCLC cells with minimal effect on the viability of normal cells. 3.3. Induction of apoptosis by treatment with NCT-50 3.4. NCT-50 displays improved safety profiles compared with known Hsp90 inhibitors and deguelin. 3.5. NCT-50 inhibits expression of client proteins of Hsp90 and shows anti-angiogenic activities. 3.6. NCT-50 inhibits Hsp90 function by binding to C-terminal ATP binding pocket of Hsp90. 4. Discussion 5. References 국문초록Maste