Avaliação do papel da família gênica EGF-CFC e suas vias gênicas de modulação nas perdas gestacionais recorrentes

As Perdas Gestacionais Recorrentes (PGR) são definidas como duas ou mais perdas gestacionais consecutivas antes das 24 semanas de gestação. É uma condição de etiologia complexa que ocorre em cerca de 5% de todos os casais que tentam ter filhos. As PGR constituem uma condição reprodutiva que merece ser alvo de investigação, já que sua etiologia permanece desconhecida em aproximadamente 50% dos casos. Vários estudos avaliaram as causas genéticas da suscetibilidade às PGR. Nesse contexto, variantes nos genes da família EGF-CFC e suas vias de sinalização são fortes candidatas, já que esses genes desempenham um papel importante na implantação, na placentação, no reconhecimento embrio-materno e no desenvolvimento embrionário. A família gênica EGF-CFC é composta pelos genes TDGF1 (Cripto-1) e CFC1 (Cryptic) que são genes do desenvolvimento fundamentais para a angiogênese e o estabelecimento dos eixos corporais. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel desta família e suas vias de sinalização nas PGR. Para isso, múltiplas abordagens foram realizadas: análise de expressão usando dados secundários do banco de dados Gene Onibus Expression (GEO); análises in silico de predições funcionais e biologia de sistemas, e um estudo de caso-controle de discriminação alélica. Análises de expressão mostraram que existe uma diminuição na expressão de TDGF1 (Cripto-1) no endométrio (p=0.049) e de CFC1 (Cryptic) (p=0.015) na placenta de mulheres com PGR, o que mostra uma possível influência dessa família nas PGR. Para esclarecer os mecanismos pelos quais esses genes poderiam estar envolvidos na patogênese das PGR, análise de redes, ontologias e revisão da literatura, de forma conjunta, apontaram um forte associação entre essa família gênica e respostas celulares a TGF- β, c-Src/MAPK/AKT, Wnt/β-catenina, Notch, TNFα, IFNγ, IL-6 e hipóxia. Essas vias desempenham papel-chave durante a gestação, controlando a proliferação celular, a decidualização, a angiogênese, a apoptose, o reconhecimento embrio-materno, a implantação embrionária, a placentação, bem como o desenvolvimento embrionário de maneira geral. Alterações em qualquer uma dessas vias podem conduzir a uma perda gestacional. Para avaliar se variações nesses genes estão relacionadas às PGR, um escore de patogenicidade foi desenvolvido pelo nosso grupo e atribuído a cada variante. Essa análise indicou que a variante rs3806702 (c.-14+1429T>C) do gene TDGF1 (Cripto-1) e a variante rs201431919 (p.Arg47Gln) do gene CFC1 (Cryptic) são as que tem o maior efeito nas PGR. Realizamos, consecutivamente, um estudo de casocontrole com 149 casos de mulheres com PGR e 159 controles sem história de infertilidade, 10 PGR, com pelo menos duas gestações a termo. Quando comparamos as frequências alélicas e genotípicas dessas variantes entre os dois grupos, a diferença encontrada por nós não foi estatisticamente significativa. No entanto, quando uma variante do gene SMAD3 (rs17293443 ou c.207-19370T>C), já relacionada à fertilidade, foi genotipada nesses grupos, observamos uma associação entre essa variante e as PGR. Isto representa outra evidência que liga uma via (TGF-β) modulada pela família de genes EGF-CFC às PGR. Embora os mecanismos moleculares precisos ainda sejam desconhecidos, existem várias evidências que nos apontam para o envolvimento da família EGF-CFC nas PGR. Ainda, mais estudos sobre essa família gênica são necessários para elucidar os mecanismos precisos que influenciam a etiologia das PGR.Recurrent Pregnancy Losses (RPL) are defined as two or more consecutive gestational losses before 24 weeks of pregnancy. This condition occurs in about 5% of all couples that try to have children, and its complex etiology remains unexplained in approximately 50% of the cases. Several studies have evaluated putative genetic causes of susceptibility to RPL. In this context, variants in the genes of the EGF-CFC family and their signaling pathways are strong candidates to be assessed, since these genes play an important role in embryo implantation, placentation, embryo-maternal recognition, and embryonic development. The EGF-CFC gene family is composed of TDGF1 (Cripto-1) and CFC1 (Cryptic), two developmental genes fundamental for angiogenesis and establishment of body axes. The aim of this study was to evaluate the role of this family and its signaling pathways in RPL. To do so, multiple approaches were employed: expression analysis using secondary data from the Gene Omnibus Expression (GEO) database; in silico analysis of functional prediction and systems biology, and a case-control study of allelic discrimination. Expression analysis showed that both TDGF1 (p=0.049) and CFC1 (p=0.015) are downregulated, respectively, in the endometrium and in the placenta of women who underwent RPL, suggesting a possible influence of this gene family in RPL. In order to clarify the mechanisms by which these genes may be involved in the pathogenesis of RPL, network analysis, ontology and literature review, all together, revealed a powerful connection between this family of genes and cellular responses to TGF-β, c-Src/MAPK/AKT, Wnt/β-catenin, Notch, TNFα, IFNγ, IL-6 and hypoxia. These pathways play a key role during pregnancy by controlling cell proliferation, decidualization, angiogenesis, apoptosis, embryo-maternal recognition, embryo implantation, placentation as well as embryonic development in general. Changes in any of these pathways may lead to a pregnancy loss. To evaluate if variations in these genes are related to RPL, a pathogenicity score, developed by our group, was attributed to each variant. This analysis indicated that TDGF1´s variant rs3806702 (c.-14+1429T>C) and CFC1´s variant rs201431919 (p.Arg47Gln) are the ones that have the greatest effect on RPL. We then carried out a casecontrol study with 149 cases of women with RPL and 159 controls with no history of infertility, RPL, with at least two full-term pregnancies. When we compared the allelic and genotypic frequencies of these variants between the two groups, the difference found by us was not statistically significant. However, when a variant of the SMAD3 gene (rs17293443 or c.207-19370T>C), already related to fertility, was genotyped in these groups, we observed an association between this variant and RPL. This represents another evidence that links one 12 pathway (TGF-β) modulated by the EGF-CFC gene family to RPL. Although the precise molecular mechanisms are still unknown, there are several pieces of evidence that point us to the involvement of the EGF-CFC family in RPL. Yet, further studies on this gene family are needed to elucidate the precise mechanisms that influence the etiology of RPL