Investigação do mecanismo de tolerância à seca em plantas transgênicas de soja que expressam uma osmotina de Solanum nigrum

Estresses ambientais são amplamente responsáveis por limitar o rendimento da soja. Para mitigar os impactos gerados pela deficiência hídrica, ferramentas de biologia molecular estão sendo utilizadas para o desenvolvimento de plantas geneticamente modificadas mais tolerantes à seca. Osmotinas ou proteínas semelhantes a osmotinas (OLPs) são moduladas sob estresses abióticos e bióticos. Estudos prévios do nosso grupo de pesquisa mostraram que dois eventos independentes (B1 e B3) de plantas transgênicas de soja expressando uma osmotina (SnOLP) de Solanum nigrum tiveram um incremento na tolerância à seca. No entanto, o mecanismo de tolerância ainda não foi elucidado. O presente trabalho tem como objetivo investigar o mecanismo de tolerância à seca das plantas de soja transgênica. As duas linhagens transgênicas foram cultivadas em recipientes plásticos (1L) contendo substrato, em sala de crescimento com temperatura e umidade controladas. Parte das plantas, no estádio vegetativo (V6), foram submetidas ao estresse hídrico pela supressão da irrigação durante sete dias. Para as demais plantas (amostras controle), o suprimento de água foi mantido. Variáveis fisiológicas (conteúdo de água na folha e fluorescência da clorofila) foram monitoradas para avaliar a condição das plantas sob estresse. Os resultados confirmaram que as plantas transgênicas apresentaram melhor desempenho quando comparadas às plantas não transgênicas. Dois conjuntos (pools) de folhas de quatro plantas por tratamento foram coletados após o período de estresse hídrico. O RNA total extraído das folhas foi utilizado para a construção de bibliotecas que foram enviadas para sequenciamento. No total, doze bibliotecas foram produzidas, e o método de sequenciamento usado foi o pair-end. As sequências resultantes do RNA-seq foram agrupadas, validadas e mapeadas no genoma da soja, disponível no banco de dados Phytozome. Os dados obtidos foram normalizados pelo DESeq2 e analisados por duas abordagens diferentes: (i) bottom-up (DESeq2) e (ii) top-down (The Transcriptogramer). Na primeira, parte-se de uma lista de genes diferencialmente expressos (DEGs) para a identificação das rotas metabólicas. Na segunda, a partir de categorias de ontologia gênica (GOs) diferencialmente expressas são identificados os DEGs. Utilizando o software DESeq2, 115 DEGs foram detectados quando plantas transgênicas foram comparadas com plantas não transgênicas (NT). Na comparação das plantas transgênicas B1 com plantas NT na condição de seca, foram detectados 87 DEGs, sendo 43 genes induzidos e 44 genes reprimidos. Da mesma forma, comparando as plantas B3 com plantas NT sob seca, foram detectados 98 DEGs, dos quais 54 genes induzidos e 44 genes reprimidos. Trinta e seis (59%) do total de 61 genes induzidos, e 34 (63%) dos 54 genes reprimidos são compartilhados pelos eventos B1 e B3. A comparação entre cada evento transgênico na situação irrigado e seca e das plantas não transgênicas na situação irrigado e seca, também foi realizada. Um total de 2044 e 1505 DEGs foram identificados em plantas transgênicas B1 e B3, respectivamente (log2FoldChange ≥ 2 e padj ≤ 0,001). Em relação ao evento B1, 769 genes induzidos e 1275 genes reprimidos. A mesma análise para B3 revelou 541 genes induzidos e 964 genes reprimidos. A exclusão dos DEGs em comum com plantas não transgênicas resultou em 395 (46.5%) genes induzidos e 234 (13.6%) genes reprimidos compartilhados pelos eventos B1 e B3. Desse total, 261 e 58 foram induzidos nos eventos B1 e B3, respectivamente; 251 e 91 foram reprimidos em B1 e B3, respectivamente. No método Transcriptogramer, os perfis de expressão foram projetados em uma lista de ordenamento e categorias de ontologia gênica. Os resultados permitiram a identificação de sete DEGs, em dez GOs diferencialmente expressas. Foi realizada, também, a análise de DEGs nas outras 6829 GOs (não diferencialmente expressas) e identificados 121 DEGs. As GOs e os DEGs estão envolvidos principalmente em processos biológicos relacionados à regulação do ciclo celular e manutenção do ambiente celular. Replicação, reparo e metilação do DNA; biossíntese do ribossomo e síntese metabólica secundária também foram moduladas. A validação dos DEGs será realizada pela técnica RT-qPCR.Environmental stresses are largely responsible for limiting soybean yield. In order to mitigate the impacts generated by water deficit, molecular biology tools are being used to develop genetically modified plants more tolerant to drought. Osmotins or osmotins-like proteins (OLPs) are modulated under abiotic and biotic stresses. Previous studies of our research group showed that two independent events (B1 and B3) of soybean transgenic plants expressing a Solanum nigrum osmotin (SnOLP) had an increment in drought tolerance. However, the tolerance mechanism has not been elucidated yet. The present study aims to investigate the drought tolerance mechanism of the transgenic soybean plants. The two homozygous transgenic lines were cultivated in plastic containers (1L) containing substrate in a growth room with controlled temperature and humidity. Part of the plants, in vegetative stage (V6), was submitted to water deficit by the irrigation suppression during seven days. For the other plants (control samples) the water supply was maintained. Physiological variables (relative leaf water content and chlorophyll fluorescence) were monitored in order to evaluate the plant condition under stress. Results confirmed that the transgenic plants presented better performance when compared to the non-transgenic (NT) plants. Two pools of leaves from four plants per treatment were collected after the period of water deficit. The total RNA extracted from the leaves was used for the construction of libraries which were sent for sequencing. In total, twelve libraries were produced, and the sequencing method used was the pair-end. The resulting sequences of the RNA-seq were clustered, validated and mapped into the soybean genome available at Phytozome database. The data obtained were normalized by DESeq2 and analyzed using two different approaches: (i) bottom-up (DESeq2) and (ii) top-down (The Transcriptogramer). In the first, a list of differentially expressed genes (DEGs) is produced and then the metabolic pathways are identified. In the second, from differentially expressed gene ontology categories (GOs) the DEGs are identified. Using DESeq2 115 DEGs were detected when transgenic plants were compared to NT plants. In the comparison of B1 versus NT plants in the drought condition, 87 DEGs were detected, in which 43 up and 44 downregulated. In the same way, comparing B3 versus NT plants under drought, 98 DEGs were detected, in which 54 up and 44 downregulated. Thirty six (59%) out of the 61 upregulated and 34 (63%) out of the 54 downregulated genes are shared by B1 and B3 events. The comparison between each transgenic event (irrigated and dry situation) and non-transgenic plants (irrigated and dry situation) was also performed. A total of 2044 and 1505 DEGs were identified in B1 and B3 events respectively (log2FoldChange ≥ 2 and padj ≤ 0.001). Regarding B1 event, 769 upregulated and 1275 downregulated. In the same way, for B3 event were detected 541 upregulated and 964 downregulated. Exclusion of DEGs in common with non-transgenic plants resulted in 395 (46.5%) upregulated and 234 (13.6%) downregulated shared by B1 and B3 events. Of this total, 261 and 58 were upregulated in B1 and B3 events, respectively; 251 and 91 were downregulated in B1 and B3, respectively. In the Transcriptogramer method, the expression profiles were projected on a list of ordering and GOs. The results allowed selecting seven DEGs within ten differentially expressed GOs. Analyzes of DEGs in the order 6829 soybean GOs (not differentially expressed) were performed and 121 DEGs were identified. The GOs and DEGs identified are mainly involved in biological processes related to cell cycle regulation and maintenance of internal cell environment. DNA replication, repair and methylation; ribosome biosynthesis and secondary metabolic synthesis were also modulated. Validation of the DEGs is being carried out by the RT-qPCR technique