Development of anti-tumor immunotherapy based on a chimeric antigen receptor (CAR) targeting the immune checkpoint HLA-G : implications for tumors and their microenvironment

Au cours de la dernière décennie, l’avènement des immunothérapies antitumorales a été une vraie percée dans le monde de la cancérologie avec le succès clinique des inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (ICP) ou des thérapies cellulaires basées sur l’utilisation de récepteurs antigéniques chimériques (CAR). Cependant, aujourd’hui elles montrent leurs limites contre les tumeurs solides, notamment à cause d’un manque d’antigène spécifique et d’un microenvironnement tumoral complexe capable de moduler la réponse immune au profit de l’expansion des cellules cancéreuses. La molécule HLA-G est une protéine immunosuppressive participant exclusivement à la tolérance foeto-maternelle en contexte normal mais dont la fonction a été détournée par les tumeurs pour inhiber la réponse effectrice à son encontre. HLA-G est donc identifié comme un excellent antigène associé aux tumeurs et son inhibition est un élément crucial pour restaurer la réponse immunitaire anti-tumorale. Cependant, aucune stratégie immunothérapeutique ciblant HLA-G n’existait jusqu’à aujourd’hui.L’absence de traitement efficace contre ou ciblant HLA-G provient de l’incapacité à générer efficacement des anticorps contre cette protéine complexe du fait de la présence de nombreuses isoformes et de leurs caractères immunotolérogéniques. Dans la première partie de ces travaux, grâce à une méthode d’immunisation originale basée sur l’utilisation de vecteurs lentiviraux, nous avons pu générer des anticorps capables de reconnaitre le site d’interaction de HLA-G avec ses récepteurs et donc de potentiellement bloquer la fonction ICP de HLA-G. La deuxième partie de cette étude décrit la génération d’une thérapie CAR ciblant HLA-G en tant qu’antigène spécifique aux tumeurs. Tout d’abord, nous nous sommes préalablement concentrés sur la régulation et l’expression de la chaine CAR au niveau transcriptionnel. Cette approche visait à limiter les multiples effets secondaires liés à une thérapie CAR tels que l’activation continue des cellules CAR-T ou l’élimination de cellules saines exprimant l’antigène ciblé. Nous avons ensuite généré deux nouveaux CAR de 3ème génération capable de reconnaitre spécifiquement les isoformes majoritaires de HLA-G en contexte tumoral, et nous avons démontré leur efficacité à éliminer des tumeurs exprimant HLA-G in vitro et in vivo. Enfin, une série d’optimisations ont été réalisées sur la structure des protéines CAR pour augmenter leur capacité cytotoxique et permettre leur régulation par l’introduction du gène suicide iC9 pour les modèles précliniques. Nous démontrons pour la première fois que la thérapie CAR anti-HLA-G est extrêmement efficace in vitro et in vivo.Enfin, nous discutons du potentiel des immunothérapies anti-HLA-G aussi bien au travers des anticorps monoclonaux bloquants que des cellules CAR-T dans le contexte des tumeurs solides, de leurs implications sur le microenvironnement et de leur possible combinaison avec d’autres immunothérapies.Over the last decade, anti-tumor immunotherapies have been a breakthrough in the oncology field following the clinical successes obtained with immune checkpoint inhibitors (ICPs) or chimeric antigenic receptors (CAR) based therapies. However, they are less effective against solid tumors, especially because of the lack of tumor specific antigen and of a tumor microenvironment capable of inhibiting the immune response favoring the tumor expansion. The HLA-G molecule is an immunosuppressive protein originally exclusively demonstrated to be involved in maternal-fetal tolerance but whose function has been hijacked by tumors to inhibit and escape from immune responses. HLA-G is now identified as an exquisite tumor associated antigen and its inhibition is crucial to restore the anti-tumor immune responses. Yet, no immunotherapy directed against HLA-G has been developed to date.The lack of effective treatment against or targeting HLA-G is related to the inefficiency to induce antibodies against this complex protein since HLA-G could be expressed through several isoforms that are immunosuppressives. In the first part of this study, thanks to an original immunization method based on the use of lentiviral vectors, we demonstrate the possibility to generate antibodies which are capable to recognize the HLA-G interaction domain with its receptors and are expected to inhibit the ICP function of HLA-G. The second part describes a CAR-T cell immunotherapy targeting HLA-G for its TAA properties. We first focused on the regulation and on the expression of the CAR chain at the transcriptional level. This approach was meant to limit the side effects caused by CAR therapies such as continuous activation of the CAR-T cells or elimination of healthy cells expressing the targeted antigen. We then generated two new 3rd generation CARs demonstrated to specifically recognize major HLA-G isoforms expressed by tumor cells and to eradicate HLA-G expressing tumor cells in vitro and in vivo. Several optimizations were carried out on the CAR chain structure to increase CAR-T cells cytotoxic function and to control their persistence through the insertion of the iC9 suicide gene. Given the results presented here, we provide the first vitro and vivo proofs of concept that a CAR therapy directly targeting HLA-G, and more generally an ICP is strikingly efficient.Finally, we discussed the potential for both anti-HLA-G blocking monoclonal antibodies and CAR-T cells immunotherapies against solid tumors and its implication against the tumor microenvironment and possible combinations with other immunotherapies