Identification of the histone chaperone Spt16, essential component of programmed genome rearrangements and DNA methylation on adenine in Paramecium tetraurelia

Chez les eucaryotes, l’organisation de la chromatine est indispensable à la régulation de l’expression des gènes et la stabilité du génome. Les ciliés constituent un excellent modèle d’étude des mécanismes qui permettent de maintenir l’intégrité du génome eucaryote. Notre modèle d’étude, l’eucaryote unicellulaire Paramecium tetraurelia, se distingue par l’élimination massive et reproductible de près de 30% de séquences d’ADN germinal lors du développement du macronoyau somatique après les événements sexuels. Ces séquences sont éliminées grâce à un processus en plusieurs étapes impliquant la formation d’hétérochromatine dirigée par de petits ARN suivi d’excision par la transposase domestiquée Piggy Mac (Pgm) et de réparation. Les mécanismes moléculaires permettant de comprendre la reconnaissance spécifique de ces séquences germinales dans le contexte de la chromatine ainsi que la précision de la coupure demeurent mal compris.Le chaperon d’histone Spt16, associée au partenaire Pob3, fait partie du complexe hétéro-dimérique FACT (FAcilitates Chromatin Transactions). FACT intervient dans de nombreux mécanismes liés au métabolisme de l’ADN tels que la transcription, la réparation, la réplication ou l’accessibilité de la chromatine. Chez Paramecium tetraurelia, on a identifié deux protéines homologues de Spt16 et Pob3 exprimées uniquement durant le développement du macronoyau au moment où se produisent les réarrangements. Les protéines Spt16-1 et Pob3-1 fusionnées à la GFP se localisent dans les macronoyaux en développement. Nous avons montré que la protéine Spt16-1 est essentielle à la production d’une descendance sexuelle viable. Le reséquençage du génome après inactivation de SPT16-1 a montré que Spt16-1 est nécessaire à l‘ensemble des réarrangements du génome et conduit à des défauts semblables à ceux obtenus suite à l’inactivation de PGM. Spt16-1 agit en aval des voies de dépôt des marques d’hétérochromatine guidées par les petits ARNs mais en amont de l’endonucléase Pgm. Nous avons montré que Spt16-1 était nécessaire à la localisation correcte de Pgm responsable de l’introduction des cassures double brin dans les macronoyaux en développement. Nous proposons un modèle dans lequel Spt16-1 favorise l’interaction de la machinerie d’excision avec la chromatine pour rendre accessible les sites de coupure sur l’ADN à Pgm.La méthylation des adénines sur l’ADN (6mA), bien connue chez les bactéries pour son rôle dans le système de restriction modification, a été décrite ces deux dernières années chez plusieurs eucaryotes en faible proportion dans le génome. Cependant son rôle chez les eucaryotes est encore peu compris. D’anciennes analyses par chromatographie à l’aide de nucléotides marqués détectaient de l’ordre de 2,5% des adénines méthylées chez P. tetraurelia mais sa localisation précise n’avait jamais été montrée. Il avait été proposé que cette modification pourrait signaler avec précision les sites de coupures pendant les réarrangements d’ADN où une partie des séquences germinales présentent des bornes AT. L’abondance des adénines méthylées fait de la paramécie un excellent modèle d’étude de cette modification. En combinant des techniques d’Immunofluorescence, d’HPLC-MS et de séquençage, nous avons ainsi décrit la présence et la localisation dans la cellule et au cours du cycle de vie de 6mA chez P. tetraurelia. Ces approches ont également permis de montrer l’absence de cytosine méthylée chez la paramécie. Nous avons montré que la méthylation des adénines était retrouvée majoritairement dans le génome somatique et de manière transitoire dans le génome germinal. Elle est établie au cours du développement du macronoyau somatique quand se produisent les réarrangements du génome. Ces résultats préliminaires permettront de poursuivre l’étude de la méthylation afin d’identifier les enzymes responsables et son rôle dans la cellule.In eukaryotes, chromatin organization is required for the regulation of gene expression and genome stability. Ciliate provide excellent model to study mechanisms involved in maintain of genome integrity. Our study model, the unicellular eukaryote Paramecium tetraurelia, has the particularity to eliminate massively and reproducibly 30% of germinal DNA sequences during the development of the somatic macronucleus after sexual events. Those sequences are eliminated by a multi-step process involving small RNA-directed heterochromatin formation followed by DNA excision by the domesticated transposase Piggy Mac (Pgm) and DNA repair. Molecular mechanisms underlying the specific recognition of those germinal sequences in chromatin context and the precision of the excision, remain elusive. The histone chaperone Spt16, associated to its partner Pob3, is part of the heterodimeric complex FACT (FAcilitates Chromatin Transactions). FACT is implicated in many mechanisms involving DNA metabolism such as transcription, repair, replication or chromatin accessibility. In P. tetraurelia, we identified two homologous proteins to Spt16 and Pob3 expressed only during macronucleus development at the time when genome rearrangements occur. Spt16-1 and Pob3-1 fused to GFP are localized in developing macronuclei. We showed that Spt16-1 is required to obtain a viable sexual progeny. Genome re-sequencing after SPT16-1 inactivation showed that Spt16-1 was required for all DNA elimination events and leads to similar phenotypes and defects to those obtained after PGM inactivation. Spt16-1 acts downstream of small RNA-directed heterochromatin formation and upstream of Pgm. We showed that Spt16-1 was required for the correct localization of Pgm responsible for DNA double strand breaks in developing macronuclei. We proposed a model in which Spt16-1 mediates interaction between chromatin and excision machinery that facilitates access to DNA cleavage sites for the Pgm endonuclease. Adenine DNA methylation, well known in bacteria for its role in restriction modification system, has been described during the last two years in several eukaryotes but in low proportion in the genome. However, its role in eukaryotes remains elusive. Previous analyses by chromatography with radio labelled nucleotides detected around 2,5% of methylated adenine in P. tetraurelia but its precise localization and role have never been analyzed. It has been proposed that this modification could mark with precision the excision sites during genome rearrangements when part of the eliminated sequences carry AT boundaries. The abundance of methylated adenine makes of Paramecium an excellent model to study this modification. Combining immunofluorescence techniques, HPLC-MS and sequencing, we described the presence and the cellular localization during life cycle of 6mA in P. tetraurelia. Those approaches allowed us to show that methylated cytosine are absent in Paramecium. We showed that methylation is mainly found in the somatic genome and transiently in germinal genome. It appears during somatic macronucleus development when genome rearrangements occur. Those preliminary results will allow us to pursue the study of adenine methylation by identifying responsible enzymes and its role in the cell