Impacte des mutations du RyR2 (R420Q) liées à la tachycardie ventriculaire polymorphe sur la fonciton du cardiomyocyte

La tachycardie ventriculaire polymorphe catécholergique (CPVT) est une arythmie génétique létale qui se manifeste par une syncope ou une mort subite chez les enfants et les jeunes adultes dans des conditions de stress sans anomalie structurelle cardiaque évidente. Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer les altérations fonctionnelles sous-jacentes de la libération de Ca2+ dues aux mutations de RyR2 ou de ses protéines accessoires. Une nouvelle mutation CPVT située sur la partie N terminale de RyR2 a été identifiée dans une famille espagnole (RyR2R420Q). Ici, nous avons utilisé un modèle de souris KI exprimant le canal RyR2R420Q et des cardiomyocytes différenciés de cellules souches pluripotentes induites (hiPS-CM) générées à partir de deux patients frères (l'un avec mutation, l'autre sans mutation utilisé comme témoin). L’analyse des cardiomyocytes ventriculaires exprimant le RyR2R420Q humain et de souris étudiées par imagerie Ca2+confocale montre une augmentation des libérations de Ca2+spontanée durant la diastole (visualisé par les Sparks Ca2+), une libération fractionnelle plus élevée et une fréquence de vagues Ca2+ proarythmogènes augmentée après stimulation à l'isoprotérénol. L’analyse électrophysiologique, étudiée en enregistrant les potentiels d'action (AP) en utilisant les techniques de micro-électrodes sur les hiPSC-CM et de patch-clamp sur les cellules ventriculaires de souris KI, a montré des post-dépolarisations retardées dépendants du Ca2+ (DAD). L’amplitude des transitoires [Ca2+]i des cellules stimulées à 1 Hz étaient plus faible chez le groupe muté. La charge en Ca2+ du réticulum sarcoplasmique (SR), estimée par application rapide de caféine (10 mM), était aussi plus réduite dans les hiPS-CM exprimant RyR2R420Q, avant et après l'application ISO (1 μM). Cependant, le RyR2R420Q semble plus enclin à libérer du Ca2+, car le transitoire [Ca2+]i normalisé par la quantité de Ca2+ stockée dans le SR, la libération fractionnaire, était plus élevée dans les cellules mutées. Même si la charge Ca2+ du SR était plus petite dans les cellules RyR2R420Q, elles présentaient souvent un comportement pro-arythmogène tel que les vagues Ca2+ pendant les périodes diastoliques. Ce comportement est encore augmentée lors de la stimulation -adrénergique. Des résultats similaires ont été observés chez les souris KI, montrant ce modèle comme un outil précieux pour étudier la maladie CPVT. Nous avons ensuite étudié l'effet antiarythmique potentiel de la venlafaxine et de la prégabaline dans les cardiomyocytes de souris KI et le hiPS-CM, deux médicaments parmi d'autres prescrits à un membre porteur de la famille et qui a montré une réversion des symptômes du CPVT après le traitement. Nous avons constaté que ces deux médicaments atténuaient les événements arythmogènes de libération du Ca2+ induits par l'ISO dans les cardiomyocytes de souris KI. La venlafaxine a montré un effet antiarythmique dans hiPS-CM à la fois en traitements aigus et chroniques.Ainsi 1) le RyR2R420Q montre une augmentation de la libération diastolique du Ca2+ , encore plus augmentée par la stimulation à l ’isoproterénol, induisant des évènements proarythmogènes. 2) les effets sont retrouvés chez des cardiomyocytes ventriculaires des souris KI et chez des cellules hiPSC-CM, montrant que ces dernières sont un outil valable pour étudier les mécanismes pathologiques ; et 3) que la Venlafaxine peut protéger des arythmies chez les patients CPVT, bien que d’avantage d’expériences sont nécessaires afin de conclure quant à son utilité antiarythmique.Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) is a lethal genetic arrhythmia that manifests by syncope or sudden death in children and young adults under stress conditions without obvious cardiac structural abnormality. Several mechanisms have been proposed to explain the underlying Ca2+ release functional alterations due to mutations of RyR2 or of its accessory proteins. A novel CPVT mutation located on RyR2 N terminal portion has been identified in a Spanish family (RyR2R420Q). Here we used a KI mice model expressing the RyR2R420Q channel, and differentiated cardiomyocytes from induced pluripotent stem cells (hiPS-CM) generated from two brother patients (one with mutation, the other without mutation used as control). Confocal Ca2+ imaging analysis showed that human and mouse RyR2R420Q expressing ventricular cardiomyocytes have higher occurrence of Ca2+ sparks, enhanced fractional release, and significantly more proarrhythmogenic Ca2+ waves after isoproterenol stimulation. The action potential (AP) analysis, recorded using the micro-electrode technique in hiPSC-CMs and patch-clamp in KI mouse ventricular cells, showed Ca2+ -dependent delayed after depolarizations (DADs). The [Ca2+]i transient amplitudes of 1-Hz paced CPVT hiPSC-CMs was similar to control hiPSC-CMs. Whereas sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ load, estimated by rapid caffeine (10 mM) application, was smaller in hiPS-CM from the RyR2R420Q carrier, both before and after 1 microM ISO application. However, the RyR2R420Q seems more prone to release Ca2+, as the [Ca2+]i transient normalized by the amount of Ca2+ stored in the SR, the fractional release, was higher in CPVT hiPSC-CMs. Even if SR Ca2+ load was smaller in CPVT hiPSC-CMs, they often presented proarrythmogenic behavior such as Ca2+ waves during diastolic periods. This behavior was further enhanced during β-adrenergic stimulation. Similar results were observed in KI mice, pointing to this model as a valuable tool to study the CPVT disease. We then studied the potential antiarrhythmic effect of venlafaxine and pregabalin in KI mouse cardiomyocytes and hiPS-CMs, two drugs among other medications that have been prescribed to one family carrier member and devoted of CPVT symptoms. We found that both of those drugs blunted ISO induced arrhythmogenic events in KI mouse cardiomyocytes. Venlafaxine showed antiarrhythmic effect in hiPS-CMs both by acute and chronic treatments.On overall, 1) the RyR2R420Q mutation shows enhanced diastolic Ca2+ release, which is further enhanced by isoproterenol inducing proarrhythmogenic events. 2) The effects were similar in hiPSC-CM and RyR2R420Q KI mice cardiomyocytes, pointing to hiPSC-CM as a valuable model to analyze pathological mechanisms; and 3) Venlafaxine may protect from arrhythmic CPVT patients, although more experiments are needed for in vivo test and to determine the mechanism of this antiarrhythmic effect