Experimental study of a multi-species bacterial biofilm model in video-microscopy : kinetics of formation and interactions between species

Pendant mon travail de thèse, j’ai caractérisé le développement d’un biofilm multi-espèces en canaux milli-fluidiques sous flux constant de milieu nutritif. J’ai tout d’abord mis au point l’utilisation d’un nouveau rapporteur fluorescent sur un biofilm d’Escherichia coli. J’ai montré les limites des rapporteurs classiques de type GFP sur le système et introduit la protéine FAST à fluorescence inductible pour les dépasser. Avec ce nouvel outil, j’ai ensuite étudié la formation d’un biofilm multi-espèces, issu d’un biofilm naturel adapté au laboratoire, constitué de Bacillus thuringiensis (Bt), Pseudomonas fluorescens (Pf), Kocuria salsicia (Ks) et Rhodocyclus sp. (R). J’ai caractérisé le développement de cette communauté par vidéo-microscopie de lumière transmise et de fluorescence, en mesurant en temps-réel les cinétiques de développement de la biomasse globale et des espèces fluorescentes au sein de la communauté. J’ai ainsi mis en évidence une succession de phases de croissance et de récession du biofilm, puis l’établissement d’état stationnaire après 30h de croissance. J’ai également trouvé que Pf, l’espèce dominante de cette communauté, opère après quelques heures un changement de niche lui donnant probablement un avantage important. Ces résultats m’ont amené à formuler l’hypothèse que le mécanisme de formation de cette communauté est gouvernée par l’équilibre de l’O2 dans le système. Enfin, j’ai étudié les 15 différentes combinaisons pouvant être formées par les membres de la communauté à la recherche d’interactions existantes entre les bactéries. J’ai pu ainsi montrer l’existence d’interactions de compétition entre Pf et Bt, la relation de parasitisme de Bt sur Ks, ainsi que celle d’amensalisme de Pf sur Ks. Nous avons aussi déterminé que R se développe de manière neutre vis-à-vis des autres espèces. Nos résultats suggèrent que ces interactions s’établissent principalement sur la base d’interactions physiques et de régulations physico-chimiques.During my PhD work, I characterized the development of a multi-species biofilm in milli-fluidic channels under constant flow of nutrient medium. I first developed the use of a new fluorescent reporter on a single-species Escherichia coli biofilm. I have shown the limitations of classical GFP type reporters on the system and introduced the inducible fluorescence protein FAST to overcome these limitations. With this new tool, I studied the formation of a multi-species biofilm, resulting from a natural biofilm adapted to the laboratory, consisting of Bacillus thuringiensis (Bt), Pseudomonas fluorescens (Pf), Kocuria salsicia (Ks) and Rhodocyclus sp. (R). I characterized the development of this adherent community by video-microscopy of transmitted light and fluorescence, by measuring in real time the kinetics of development of global biomass and fluorescent species within the community. I thus highlighted a succession of phases of growth and recession of the biofilm, then the establishment of stationary state after 30h of growth. I also found that Pf, numerically the dominant species of this community, operates after a few hours a change of niche probably giving him an important advantage. These results led me to formulate the hypothesis that the formation mechanism of this adherent community is largely governed by the equilibrium of O2 in the system. Finally, I have studied the different combinations that can be formed by members of the community in search of existing interactions between bacteria. I was able to show the existence of competitive interactions between Pf and Bt, the parasitism relation of Bt on Ks, as well as that of amensalism of Pf on Ks. We also determined that R develops in a neutral way towards the other species. Our results suggest that these interactions are mainly based on physical interactions and physicochemical regulation