Structural studies of trans-translation, an attractive target for new antibiotics development

Le travail retranscrit dans cette thèse porte sur un processus biologique impliqué dans le contrôle qualité de la synthèse protéique bactérienne : la trans-traduction. Ce processus permet de libérer les ribosomes bloqués sur des ARNm défectueux tout en détruisant les peptides et ARNm problématiques impliqués dans le blocage. Il nécessite deux acteurs principaux qui interagissent avec le ribosome: l’ARN transfert-messager (ARNtm) et la protéine SmpB. Dans un premier chapitre, une étude en cryo-microscopie électronique à transmission (cryo-MET) a permis d’obtenir deux structures à l’échelle atomique impliquant le ribosome et différents acteurs de la trans-traduction. La première structure met en évidence l’interaction entre la RNase R, enzyme responsable de la destruction des ARNm défectueux, et le ribosome bactérien. La deuxième structure a mené à la caractérisation des deux premiers états de la trans-traduction à une résolution quasi-atomique. De nouvelles interactions sont notamment observées entre la protéine SmpB et l’hélice H5 de l’ARNtm. Dans un second chapitre, la trans-traduction est exploitée comme cible pour le développement de nouveaux antibiotiques. En effet, cette voie de sauvetage est souvent vitale ou alors indispensable à la virulence bactérienne. Dans l’objectif de découvrir de nouvelles molécules antibiotiques inhibant la trans-traduction, nous avons mis au point un système de détection de la trans-traduction in vitro. Ce système est simple et rapide, basé sur la mesure de la fluorescence d’une GFP tronquée, réassemblée par un ARNtm muté. La validation du système a conduit à la détection de nouveaux composés anti-trans-traduction.This work is focused on a biological process which controls bacterial protein synthesis, trans-translation. This all-in-one process allows the rescuing of ribosomes stalled on defective mRNA, the degradation of the problematic peptides and mRNA. It is driven by two principal actors that interact with the ribosome: transfer-messenger RNA (tmRNA) and Small protein B (SmpB). In a first chapter, by a cryo-electron microscopic (cryo-EM) study, two near-atomic resolution structures, involving the ribosome and various trans-translation actors, were obtained. The first one highlights the interactions between RNase R, an enzyme responsible for mRNA degradation during trans-translation, and the bacterial ribosome. The second one corresponds to the characterization of two early trans-translation states at a near-atomic resolution. New interactions have been observed between SmpB and tmRNA H5 helix. In a second chapter, trans-translation is used as a target for the development of new antibiotic molecules. Indeed, this pathway is often necessary for bacterial survival and pathogenicity. Towards this aim, we designed and set up a new in vitro assay for high-throughput screening assays. This efficient system is based on fluorescence measurements of a GFP reassembled through trans-translation by a mutated tmRNA. This system has been validated and will be used for the discovery of new anti-trans-translation compounds