Caractérisation fonctionnelle et structurale de la flippase de levure Drs2p/Cdc50p et de la flippase humaine ATP8B1/CDC50A impliquée dans une maladie

Les cellules sont entourées de membranes lipidiques organisées en bicouche séparant ainsi le milieu intracellulaire du milieu extérieur. L’une des caractéristiques des cellules eucaryotes est de posséder une distribution asymétrique des lipides constituants les membranes de la voie sécrétoire. En effet, dans ces membranes, la phosphatidylcholine (PC) et les sphingolipides (SL) sont majoritairement retrouvés sur le feuillet externe alors que la phosphatidylsérine (PS) et la phosphatidyléthanolamine (PE) sont séquestrées sur le feuillet interne. Cette asymétrie est maintenue grâce à la présence de transporteurs de lipides. Parmi ces transporteurs, on retrouve les flippases, qui grâce à l’énergie apportée par la consommation d’ATP, transportent les lipides du feuillet interne vers le feuillet externe. Les flippases appartiennent à la superfamille des ATPases de type P et ont été reliées à différentes pathologies humaines lorsqu’elles sont mutées. Par exemple, des mutations du gène ATP8B1 sont responsables d’une forme de cholestase intrahépatique, une maladie hépatique sévère. Dans cette thèse, nous avons étudier le mécanisme de régulation de deux flippases : la flippase de levure PS spécifique Drs2p/Cdc50p ainsi que la flippase humaine ATP8B1/CDC50A. Les deux flippases ont été exprimées dans la levure de bière S. cerevisiae et purifiées afin de réaliser leur caractérisation fonctionnelle. Nos résultats montrent que les deux flippases sont régulées par des phosphoinositides et auto-inhibées par leurs extrémités N- et C-terminales.Living cells are surrounded by membranes organized in bilayers, separating the intracellular medium from the extracellular environment. A hallmark of eukaryotic membranes from the late secretory/endocytic pathways is the asymmetric distribution of phospholipids between the two leaflets. Indeed, phosphatidylcholine (PC) and sphingolipids (SL) are mainly found in the outer leaflet whereas phosphatidylserine (PS) and phosphatidylethanolamine (PE) are sequestered in the inner leaflet. This asymmetry is maintained thanks to different membrane lipid transporters. Among them, flippases, which are transporters fueled by ATP hydrolysis, translocate lipids from the outer to the inner leaflet. Flippases belong to the P4-ATPase family and have been linked to several diseases. For instance, mutated forms of a human P4-ATPase, ATP8B1, are responsible for intrahepatic cholestasis, a severe liver disease. In this thesis, we investigated the regulatory mechanism of two flippases, the yeast PS-specific flippase complex Drs2p/Cdc50p, and the human disease-related flippase complex ATP8B1/CDC50A. Both proteins were expressed in S. cerevisiae and purified for downstream functional characterization. Our results demonstrate that both flippases are tightly regulated by phosphoinositides and autoinhibited by their N- and C-terminal extensions