Club cells and environmental respiratory susceptibility

La BPCO (BronchoPneumopathie Chronique Obstructive) est une maladie chronique des voies aériennes où prédominent modifications structurelles et inflammation. Le but de ce travail a été d’étudier différents axes caractéristiques de cette pathologie comme l’hyperplasie des cellules à mucus, le déficit en cellules Club et la dérégulation des alarmines pour trouver de nouvelles cibles thérapeutiques.Tout d’abord, nous avons réalisé la carte d’identité des cellules Club issues de cultures en interface air-liquide (ALI) de cellules épithéliales bronchiques humaines par deux méthodes (Single cell-RNAseq et puces à ADN). Les résultats obtenus en Single cell-RNA seq montrent que la totalité des cellules épithéliales expriment l’ARNm CCSP. Pour pallier à ce problème, nous avons triées les cellules selon l’expression de leur protéine spécifique SCGB1A1. Les puces à ADN ont identifié trois populations exprimant la protéine CCSP (fluorescence et granulosité différentes). Ces différentes populations ont une expression d’ARNm de type ciliée ou de type classique « Club ». Ceci permet de montrer la plasticité de ces cellules et leur potentiel pour rétablir un épithélium différencié. Ensuite, nous avons montré que les voies de signalisation BMP et Notch sont déterminantes pour le devenir des cellules épithéliales des voies aériennes. Par conséquent, il est possible de maîtriser la différenciation des cellules provenant de cultures ALI NHBE et HBEC en cellules ciliées, caliciformes, Club ou basales. Un inhibiteur de Notch, le DapT, permettait de rétablir le déséquilibre caractéristique de la BPCO en favorisant le phénotype cilié, mis en évidence aussi bien en immunofluorescence qu’en single cell RNAseq. A partir des données obtenues, il est possible d’envisager de superviser le phénotype des cellules épithéliales des voies aériennes. Pour finir, nous avons étudié différents profils de sécrétions d’alarmines dans les cultures ALI de cellules épithéliales bronchiques humaines à l’état basal. TSLP et IL33 apparaissaient augmentées dans la BPCO, tandis que l’IL25 était diminuée comparé aux sujets sains et aux asthmatiques. Ces patterns d’expression étaient associés de manière hétérogène aux marqueurs cliniques de l’inflammation de type 2. Pour conclure, il n’y a donc pas une mais des cellules Club, aux morphologies, profils transcriptomiques et fonctions différentes, engagées vers des voies de différenciation distinctes. Le relatif maintien d’un profil cytokinique de type T2 d’un épithélium cultivé en ALI en relation avec les données cliniques valide ce modèleCOPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease) is characterized primarily by parenchymal structural changes and inflammation. The aim of this work was to study different characteristics of this pathology such as mucus cell hyperplasia, Club cell deficits and alarmin deregulation in order to find new therapeutic targets. First, we used two transcriptomic methods (Single cell-RNAseq and DNA chips) on air-liquid interface (ALI) cultures of human bronchial epithelial cells to produce a Club cell “identity card”. Single cell-RNA seq results demonstrated that all epithelial cells express mRNA for Club cell secretory protein (CCSP), the biomarker classically used for identifying Club cells. To overcome this ubiquity problem, we sorted the cells according their relative level of SCGB1A1 (the gene encoding CCSP) protein expression. DNA chips identified three CCSP-expressing cell populations differing by fluorescence level and/or scatter. These different populations expressed not only classic "Club" mRNA transcripts, but also markers associated with ciliated cells, highlighting their plasticity and potential to restore a differentiated epithelium. We then demonstrated that the BMP and Notch signaling pathways determine the fate of airway epithelial cells, consequently enabling differentiation of cells from ALI NHBE and HBEC cultures into ciliated, goblet, Club or basal cells. A Notch inhibitor, DapT, restored the characteristic imbalance of COPD by promoting the ciliated phenotype, (demonstrated both by immunofluorescence and via single cell RNAseq). It is therefore now possible to control the phenotype of the airway epithelial cells in culture. Finally, we studied different alarmin secretion profiles in ALI cultures of HBECs at basal state. TSLP and IL33 appeared to be increased in COPD, while IL25 was decreased compared to healthy subjects and asthmatics. These expression patterns were heterogeneously associated with clinical markers of type 2 inflammation.In conclusion, there is not a single Club cell, but multiple types of Club cells with different morphologies, transcriptomic profiles and functions that are committed to different differentiation pathways. The relative maintenance of a T2 cytokine profile of the epithelial cells cultivated in ALI in accordance with clinical data strongly supports the validity of the model