Investigation of asymmetric repartition of lytic and signaling molecules in dividing human CD8+T cells

Les lymphocytes T CD8+ humain répartissent asymétriquement leur contenue lytique au cours de la division cellulaire via la mise en place d'un mécanisme stochastique. L'hétérogénéité des réponses cellulaires est une caractéristique clé des réponses immunitaires. Celle-ci assure la présence de cellules dotées de fonctions distinctes dont l'étroite collaboration permet une reconnaissance efficace des antigènes, l'activation des cellules effectrices, l'élimination des pathogènes et l'établissement d'une immunité à long terme. Les travaux antérieurs de l'équipe du Dr Valitutti, basés sur une approche "unicellulaire", ont révélé un niveau supplémentaire d'hétérogénéité au sein des clones effecteurs, lymphocytes T CD8+. Ces travaux ont montré que les lymphocytes T CD8+, tous génétiquement identiques et spécifiques d'un même antigène, présentent des capacités à éliminer leurs cellules cibles fortement hétérogène. Vasconcelos et al. ont également démontré que les propriétés fonctionnelles d'une cellule T CD8+ individuelle ne sont pas héritées par les cellules filles lors de la division cellulaire, au contraire, l'expansion d'une seule cellule conduit à la génération d'une population clonale dotée d'une hétérogénéité fonctionnelle élevée. Le but de mon travail de doctorat est de mieux comprendre le phénomène de l'hétérogénéité fonctionnelle des cellules T CD8+ humaines et son lien fonctionnel possible avec la division cellulaire. Pour résoudre ce problème, nous cherchons à savoir si la répartition asymétrique des composants moléculaires peut se produire pendant la division des cellules T CD8+ humaines (cellules polyclonales fraîchement isolées et CTL clonales). Pour étudier la distribution des protéines au cours de la division cellulaire, nous avons choisi de nous concentrer sur les cellules en télophase (dernière étape de la mitose avant la séparation des cellules filles). Parce que les cellules en télophase sont extrêmement rares dans la population G2/M et présentent de faibles capacités d'adhésion, nous avons développé un protocole d'acquisition et d'analyse utilisant la cytométrie en flux (IsX, MERK), une technologie combinant les avantages de la cytométrie en flux (hautement quantitative) et de la microscopie (analyse détaillée des cellules individuelles), pour obtenir des résultats hautement quantitatifs permettant la détermination sans ambiguïté des niveaux de protéines hérités par chacune des cellules filles composant une télophase. Nos résultats montrent que les vésicules intracellulaires CD107a+ (correspondant aux lysosomes et granules lytiques) et les molécules lytiques (perforine/granzyme B) sont inégalement séparées au cours de la télophase, générant ainsi à chaque division des cellules filles dotées d'un potentiel lytique distinct. La cytométrie d'imagerie en flux montre également la répartition inégale de mTOR et de son substrat principal, la phospho-S6 ribosomal protein pendant la division. Ces résultats, ainsi que notre observation selon laquelle la fonction mTORC1 est essentielle pour alimenter l'élimination durable des cellules cibles en surnombre, appuient notre constatation selon laquelle le potentiel lytique des CTL est hérité de façon asymétrique pendant la division. Intéressement, nos études mettent en évidence un mécanisme de division asymétrique, générateur d'hétérogénéité au sein de populations clonales, indépendant d'un signal polarisant, de la mise en place d'un axe de polarité et maintenant de l'hétérogénéité sans génération de sous populations phénotypiquement différentes. Pour finir nos résultats, appuyés par des études mathématiques démontrent un mécanisme stochastique, non héritable, observable à tous les cycles de division, où chaque événement est capable ou non de réaliser un événement de division asymétrique indépendamment de sa cellule mère.Cellular responses' heterogeneity is a key feature of immune responses. It ensures the presence of cells endowed with distinct functions whose close collaboration allows efficient antigen recognition, activation of effector cells, pathogen elimination and the establishment of long-term immunity. Previous work in the Team of Dr. Valitutti, based on a "single cell" approach, revealed an additional level of heterogeneity within clonal effector CD8+ T lymphocytes. This work showed that CD8+ T lymphocytes, all genetically identical and specific for the same antigen, exhibit highly heterogeneous capability in target cell killing. Vasconcelos and al. also demonstrated that functional properties of an individual CD8+ T cell are not inherited by daughter cells upon cell division, on the contrary, expansion of a single cell leads to the generation of a clonal population endowed of a high functional heterogeneity. The aim of my PhD work was to better understand the phenomenon of functional heterogeneity of human CD8+ T cells and its possible functional link with cell division. To address this issue, we investigated whether asymmetric repartition of molecular components could occur during human CD8+ T cell division (both freshly isolated polyclonal cells and clonal CTL). To study protein distribution during cell division, we chose to focus on cells in telophase (the last stage of mitosis before daughter cell separation). Because telophase cells are extremely rare in the G2/M population, and exhibit low adhesion capacity, we developed an acquisition and analysis protocol using imaging flow cytometry (IsX, MERK), a technology combining the advantages of both flow cytometry (highly quantitative analysis of cell populations) and microscopy (detailed analysis of individual cells), to acquire highly quantitative results allowing the unambiguous determination of the protein levels inherited by each of the nascent-daughter cell in telophase. Our results show that CD107a+ intracellular vesicles (corresponding to T lymphocyte lysosomes and lytic granules) and lytic molecules (such as perforin and granzyme B) are unevenly segregated in telophase, thus generating at each divisions daughter cells equipped with different amounts of lytic potential. Imaging flow cytometry also shows the uneven repartition of mTOR and of its main substrate phospho-S6 ribosomal protein during division. These results together with our observation that mTORC1 function is instrumental to fuel sustained killing of outnumbering target cells, support our finding that CTL lytic potential is asymmetrically inherited during division. Three lines of evidences indicate that the observed uneven segregation of effector molecules in dividing human CD8+ T cells is not part of a classical mechanism of fate determining asymmetric cell division (ACD), such those described in embryogenesis. 1) In spite of effector molecules asymmetric distribution in telophase, we observed homogeneous partitioning of fate determining factors (such as the transcription factors T-bet and C-myc and the partitioning molecules PKC?;, PAR6 and Numb) during CD8+ T cell division. 2) The process of asymmetric repartitioning of effector molecule occurs at each division round and is not hereditary, e.g. a daughter cell originating from a heterogeneous division has a constant stationary probability to produce a new uneven division. 3) The observed asymmetric repartition of effector molecules does not require a polarity cue as described in classical ACD processes. Taken together our results reveal a novel mechanism of stochastic uneven molecular segregation in telophase of lytic molecules and signaling components that randomly generates heterogeneity within human CD8+ T cell populations and might contribute to the flexibility and robustness of adaptive immune responses