Infectious cycle of hepatitis A virus (HAV) and development of in vitro models to highlight its infectivity

Le virus de l’hépatite A (VHA) est un virus entérique à transmission féco-orale qui est responsable d’hépatites aigües. Le VHA est à ce jour le 2ème agent étiologique viral pouvant être impliqué dans les toxi-infections alimentaires collectives (TIAC). Pour apprécier le risque en virologie alimentaire, la détection d’ARN reste insuffisante pour la mise en évidence de virions infectieux. Actuellement, les souches sauvages du VHA sont difficilement cultivables : elles se répliquent très lentement en culture (libération de nouveaux virions synthétisés dans les cellules Frhk-4 à partir de 30-45 jours) sans induire d’effet cytopathogène (ECP). A l’inverse, certaines souches du VHA adaptées en culture sont capables d’induire un ECP résultant de la mort par apoptose des cellules infectées. Mes travaux de thèse visaient donc à développer une nouvelle méthode de détection par impédancemétrie des particules virales infectieuses du VHA dans le cadre du diagnostic viral dans les aliments.Dans cette étude, à l’aide de la technologie xCELLigence, l’évaluation du système d’analyse cellulaire en temps réel (« Reel Time Cell Analysis » (RTCA)) a été entreprise pour détecter l’ECP de la souche adaptée du VHA (HM175/18f) sur les cellules FRhK-4. Les résultats ont montré que les cinétiques d'impédance cellulaire, au cours de l’infection par le VHA, induisait une diminution de l'indice cellulaire (CI) en corrélation avec l'apparition de la mort cellulaire induite par le VHA. De plus, le temps nécessaire à la chute des valeurs de CI induite par le VHA dépendait de la concentration virale. Une relation linéaire sur 5 log10 a pu être établie entre la concentration du VHA et le temps nécessaire pour atteindre 50% de la diminution des valeurs de CI (TdCI50) montrant ainsi que le suivi par RTCA pouvait être utilisé comme méthode de titrage infectieux du VHA. En outre, le suivi par RTCA peut être effectué en moins de six jours au lieu de 12 à 14 jours avec les méthodes standards de titrages en plages de lyses. Par conséquent, la méthode de titrage basée sur le suivi par RTCA est un outil puissant pour l’évaluation des traitements d’inactivation virale et antiviraux.Par ailleurs, dans le but d’être en mesure de reproduire un ECP chez les souches sauvages du VHA, les voies de signalisation pro-apoptotiques caspase-dépendantes impliquées dans la mort cellulaire par apoptose des cellules infectées par la souche adaptée ont été étudiées. A partir de résultats antérieurs montrant l’activation de la caspase 3 au cours de l’infection des cellules FRhK-4 par la souche HM175/18f du VHA, les voies extrinsèques et mitochondriales pro-apoptotiques ont été identifiées. L’expression de la caspase 8, marqueur de la voie extrinsèque, en corrélation avec l’expression de la caspase 3 active ainsi que de la protéine tBid a été observée. De plus, l’expression de la protéine tBid induisait la libération du cytochrome c suggérant une activation de la voie mitochondriale dépendante de la voie extrinsèque. Par conséquent, une comparaison des voies de survie et de mort cellulaire au cours de l’infection par les souches sauvages et adaptée du VHA pourra être réalisée dans de prochains travaux. Ainsi, les résultats offrent de nouvelles perspectives dans la compréhension sur la stratégie virale pour induire un ECP dans les cellules hôtes.En conclusion, au-delà d'une meilleure compréhension de la physiopathologie du VHA, cette étude contribue au développement de modèles cellulaires pour détecter les particules infectieuses des souches sauvages du VHA. De plus, le suivi par RTCA dans les études d'inactivation du VHA améliorera l'évaluation du risque viral en virologie alimentaire, en contrôlant la transmission des virus, par leur élimination des denrées alimentaires. Ceci constitue également un enjeu en santé publique important pour réduire le fardeau des maladies virales d'origine alimentaire.Hepatitis A virus (HAV) is a fecal-oral enteric virus that causes acute hepatitis. After entering the body orally, HAV interacts with the intestinal epithelium that it must cross to reach the liver via the bloodstream. HAV is to date the second viral etiological agent that can be involved in collective foodborne illness (TIAC). To assess the risk in food virology, the detection of RNA remains insufficient for the detection of infectious virions. Today, cultivating wild strains of HAV is difficult: they replicate very slowly in culture (release of new virions synthesized in Frhk-4 cells from 30-45 days) without inducing cytopathic effect (CPE). In contrast, some culturally adapted HAV strains are capable of inducing CPE resulting from apoptotic death of infected cells. My thesis work aimed to develop a new method of impedance detection of infectious viral particles of HAV in the context of viral diagnosis in food.In this study, using xCELLigence technology, the evaluation of the Real Time Cell Analysis (RTCA) system was undertaken to detect the ECP of the HAV adapted strain. (HM175 / 18f) on FRhK-4 cells. The results showed that cell impedance kinetics, during HAV infection, induced a decrease in cell index (CI) correlated with the occurrence of HAV-induced cell death. In addition, the time required for the fall in HAV-induced IC values was depending on the viral concentration. A linear relationship of 5 log10 could be established between the HAV concentration and the time required to reach 50% of the decrease in IC values (TdCI50), showing that RTCA monitoring could be used as an infectious HAV test method. In addition, RTCA monitoring can be performed in less than six days instead of 12 to 14 days with standard lysis range assays. Therefore, the titration method based on RTCA monitoring is a powerful tool for the evaluation of viral inactivation and antiviral treatments.Moreover, in order to be able to reproduce ECP in wild HAV strains, the pro-apoptotic caspase-dependent signalling pathways involved in apoptotic cell death of cells infected with the adapted strain were studied. From previous results showing the activation of caspase 3 during the infection of FRhK-4 cells by the HM175 / 18f strain of HAV, the extrinsic and mitochondrial pro-apoptotic pathways were identified. The expression of caspase 8, a marker of the extrinsic pathway, correlated with the expression of active caspase 3 as well as tBid protein was observed. In addition, the expression of the tBid protein induced the release of cytochrome c suggesting activation of the extrinsic pathway-dependent mitochondrial pathway. Therefore, a comparison of survival and cell death pathways during infection with wild-type strains and adapted to HAV can be performed in future work. Thus, the results offer new insights into the understanding of viral strategy for inducing ECP in host cells.In conclusion, beyond a better understanding of the pathophysiology of HAV, this study contributes to the development of cellular models to detect infectious particles of wild strains of HAV. In addition, RTCA monitoring in HAV inactivation studies will improve the assessment of viral risk in food virology by controlling the transmission of viruses through their elimination from food. This is also an important public health challenge to help reduce the burden of food-borne viral diseases