Analysis of the molecular mechanisms of TLR3 signalling pathway using a genome wide genetic screen

La défense de l’organisme contre des pathogènes passe par la détection de motifs moléculaires spécifiques de ces derniers. Dans l’arsenal de récepteurs capables de reconnaître ces motifs figure la famille des Toll-like receptors (TLR) endosomaux, spécifiques d’acides nucléiques. Parmi eux, TLR3 détecte la présence anormale d'ARN double brin dans les endosomes et initie une forte réponse immunitaire innée. Cependant, la régulation de TLR3 reste encore mal comprise. Pour identifier de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans la voie TLR3, nous avons réalisé un crible à l'échelle du génome en utilisant la technologie CRISPR / Cas9. Nous avons développé une lignée de cellules rapporteuses de la voie TLR3, puis générés des mutants en transduisant ces cellules avec une banque d’ARNg. Les cellules ont ensuite été soumises à des cycles de stimulation par du poly (I:C) suivi de tri des cellules GFP-. L’enrichissement de certains ARNg au sein de la population triée, souligne l’importance des gènes correspondant dans la voie TLR3. Cinq gènes, dont TLR3, connu pour être nécessaire à la voie de TLR3, ont été identifiés par le crible, validant ainsi notre stratégie. Nous avons étudié les 40 meilleurs candidats issus du crible. Parmi les candidats confirmés, nous nous sommes concentrés sur AhR (récepteur d’aryl d’hydrocarbone). En l’absence d’AhR la réponse médiée par TLR3 est impactée de deux manières avec une perte de production d'IL-8 et une augmentation de celle d'IP-10. Dans les macrophages humains primaires exposés au poly(I:C), l’activation d’AhR améliore la production d’IL-8 et inhibe celle d’IP-10. Ainsi, AhR semble capable de moduler la réponse du TLR3.The fight of the organism against pathogens involves the detection of molecular patterns that are conserved among pathogens. Among the arsenal of receptors capable of recognizing these patterns, there is the family of endosomal Toll-like receptors (TLRs) that are specific for nucleic acids. Among them, TLR3 senses the abnormal presence of double-stranded RNA in the endosomes and initiates a potent innate immune response. Nevertheless, mechanisms governing TLR3 regulation still remain poorly understood. To identify new molecular players involved in the TLR3 pathway, we performed a genome-wide screen using the CRISPR/Cas9 technology using reporter cells expressing GFP when stimulated via TLR3. Mutagenesis was achieved by transducing these cells with the lentiviral GeCKO v2 sgRNA library. Cells were then subjected to sequential rounds of stimulation with poly(I:C) and sorting of the GFP- cells. Enrichments in sgRNA estimated by deep-sequencing identified genes required for TLR3-induced activation of NF-κB. Five genes, including TLR3 itself and the chaperone UNC93B1, known to be critically involved in the TLR3 pathway, were identified by the screen, thus validating our strategy. We further studied the best 40 hits. Among the hits confirmed, we focused on AhR (aryl hydrocarbon receptor). Depletion of AhR had a dual effect on the TLR3 response, abrogating the IL-8 production and enhancing the IP-10 release. Interestingly, in primary human macrophages exposed to poly(I:C), AhR activation enhanced IL-8 and inhibited the IP-10 one. Overall, AhR appears able to modulate the TLR3 response