Heterospermic insemination in bitches

Cilj heterospermičnog osjemenjivanja pasa je dobivanje legala od dva različita oca, što daje mogućnost veće genetske raznolikosti uslijed specifičnog spolnog ciklusa kuje te daje podjednake šanse mužjacima za dobivanje legla. Istraživanje je provedeno u razdoblju od 2 godine na 2 spolno zrele ženke i 5 mužjaka pasmine mali vendenski baset grifon koje su u 3 legla oštenile 14 štenadi. Ukupno su provedena 3 heterospermična osjemenjivanja. U istraživanje je uključena i internacionalna anketa koju su ispunili uzgajivači iz iz Amerike, Danske, Finske, i Australije koji su koristili ovaj način rasplođivanja. Prije svakog osjemenjivanja mužjacima je uzeto sjeme radi određivanja kvalitete ejakulata. Ocijenjen je volumen, progresivna pokretljivost, morfologija, koncentracija i vitalnost spermija (HOS test i bojenje po Bloom-u). Optimalno vrijeme osjemenjivanja određivano je mjerenjem koncentracije progesterona u serumu. Kao početak ovulacije uzeta je vrijednost od 4.2 ng/mL. U dva heterospermična osjemenjivanja kuje su osjemenjene tehnikom transcervikalne inseminacije svježim, prethodno pomiješanim sjemenom 2 odabrana mužjaka, dok je jedno osjemenjivanje učinjeno s duboko smrznutim sjemenom 2 odabrana mužjaka tehnikom kirurške inseminacije. Inicijalno individualno testiranje mužjaka pokazalo je minimalne razlike u kvaliteti sjemena koja je kod svih mužjaka bila je unutar referentnih vrijednosti za sve ispitivane parametre. Ocjenom sjemena na dan osjemenjivana utvrđena su minimalna odstupanja u kvaliteti te je sjeme odabranih mužjaka pri svakom osjemenjivanju bilo približno jednake kvalitete. Volumen ejakulata je prilagođen za svako osjemenjivanje, s obzirom na kvalitetu sjemena, kako bi svaki mužjak imao jednake šanse za oplodnju. Svi psi su prethodno imali napravljen DNK profil. Kuje su se štenile 58-60 dana nakon osjemenjivanja. Za dokazivanje očinstva krv štenadi uzeta je neposredno nakon štenjenja iz umbilikalne vene ili u dobi od 5 tjedana venepunkcijom iz jugularne vene u EDTA epruvete. Rezultati su pokazali da je u prvom leglu oštenjeno 6 štenadi od mužjaka A (4 ♂, 2♀) i 1 štene od mužjaka B (♂), u drugom leglu je oštenjeno 6 štenadi (3 ♂, 3♀) od mužjaka A, a u trećem 1 štene (1♀) od mužjaka B. Jednojajčani blizanci nisu utvrđeni. Internacionalna anketa je pokazala da je najbolji omjer očeva bio kod kirurškog osjemenjivanja sa smrznutim sjemenom (5:5), dok su preostala legla koja su uključivala prirodno parenje ili osjemenjivanje prethodno pomiješanim sjemenom imala omjer očeva u korist jednog, dominantnijeg mužjaka. Veći broj štenadi u leglu nakon heterospermičnog osjemenjivanja primjećen je u danskoj uzgajivačnici patuljastih pasmina kod kuja prethodno dokazane plodnosti.The idea of heterospermic insemination in dog breeding is to give equal chances to both possible males to fertilize the eggs due to specific oestrus cycle of the bitch. The data was collected in the period of 2 years from 2 breeding bitches with genetically proven reproductive history. Bitches belong to the breed Petit Basset Griffon Vendeen that produced alltogether 3 litters and 14 puppies. In order to get more objective results we have included data from international questionaire that was presented to the breeders worldwide. Prior every breeding with fresh semen stud dogs semen was collected and evaluated for the following parameters: colour, volume, progressive motility, morphology, concentration, viability and functional integrity of sperm membrane (HOS test and Bloom staining). Breeding time of each bitch was determined by measuring progesterone (P4) levels. P4 concentration at the onset of ovulation was 4,2 ng/mL. Two inseminations with fresh mixed semen were done using transcervical insemination, while 3rd insemination with frozen semen was done surgically. Initial individual semen testing showed minimum deviations in all tested parameters as well as on the days of inseminations. Semen volume was adjusted for each breeding based on quality parameters, to give equal chances to both males to fertilize eggs. All dogs had DNA profiles done before inseminations. Puppies were born 58- 60 days after 1st insemination. Blood samples were collected on week 5 via jugular venipuncture or after birth via umbilical venipuncture into EDTA vacutainer tubes for genetic analysis. Final results in 1st dual sired litter showed 6 puppies from stud A (4 ♂, 2♀) and 1 puppy from stud B (♂), second litter showed 6 puppies(3 ♂, 3♀) from stud A, third litter showed 1 puppy (1♀) from stud B. No monozygotic twins were born. Based on international questionaire, the best parentage ratio was after surgical insemination with frozen semen (5:5), while other litters that included either natural matings or mixed fresh semen showed litters with one sire dominating over other in the parentage ratios. Improved reproductive performance was detected in Danish toy breed kennel within bitches with previously proven reproductive history