Investigation of Genetıcal Material Decorated Nanoparticles Usability as a New Generation Biochemical Strategy in Cancer Therapy

Breast cancer (BC) is the second most frequently diagnosed cancer type worldwide. Triple negative breast cancer (TNBC) type is a considerably aggressive one compared to other breast cancer subtypes with high metastasis, relapse and mortality rate in patients. Due to its significant genetic heterogeneity and deficiency of molecular targets such as estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR) and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), no effective targeted therapy strategies are available for TNBC. In recent years, emerging evidence has revealed that short non-coding microRNAs (miRNA) are broadly involved in various cancer pathophysiological processes including cell cycle, proliferation, differentiation, migration/invasion and aging, via regulating the expression of the target genes that are active in those pathways. miRNAs gain an important role as therapeutics by enabling the degradation of the target mRNA or the inhibition of translation. Therefore, miRNA-based therapeutics may be a novel therapeutic approach, especially for TNBC patients. However, safe and efficient delivery systems are required for miRNAs to be successfully used in clinical trials. In the presented study, poly-L-lysine (PLL) modified sericin (Ser) coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) (PLL/Ser-SPIONs) were synthesized and characterized as miRNA delivery vehicle for TNBC therapy. PLL/Ser-SPIONs were obtained in a size range of 25-30 nm with a cationic zeta potential value that is +13 mV. The nanoparticles were interacted with different concentrations of miRNA (miR) control and the range of the binding efficiencies was found to be as 97-99%. Transmission electron microscopy (TEM) and confocal microscopy analyses exhibited that miR-control or control small interfering RNA (siRNA) loaded PLL/Ser-SPIONs were successfully uptaken by TNBC (MDA-MB-231) cells. miR-329 was chosen as a target miRNA after analyzing several miRNA databases and discovering that its overexpression is related to high survival rate in patients with TNBC. It was demonstrated by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR) that miR-329 expression level is significantly reduced in many TNBC cell lines. In vitro delivery of miR-329 either using PLL/Ser-SPIONs or a commercial transfection reagent inhibited proliferation, invasion/migration and enhanced apoptosis rate in TNBC cells. The underlying molecular mechanism of miR-329 based therapy was investigated via a number of target prediction algorithms and they showed that miR-329 has binding sites at three prime untranslated region (3’-UTR) of eukaryotic elongation factor-2 kinase (eEF2K) and AXL genes. In addition, by Western Blot assay, upregulated levels of both eEF2K and AXL were observed in TNBC cells, and it was also found that these genes are associated with shorter overall survival in TNBC patients. More important, after miR-329 delivery in TNBC cells, both eEF2K and AXL expressions were remarkably inhibited. The TNBC cells were also treated with specific siRNAs for eEF2K and AXL, and silencing these genes recapitulated the effects of ectopic expression of miR-329 by reducing the cell growth and invasion/migration. Furthermore, in vivo delivery of miR-329 loaded PLL/Ser-SPIONs led to a drastic inhibition in tumor growth in TNBC orthotopic xenograft models (MDA-MB-231 and MDA-MB-436) in mice. A significant knockdown of eEF2K and AXL levels was also observed in tumor samples by Western Blot analysis. In addition, PLL/Ser-SPIONs-miR 329 treatment in mice did not cause any detectable side effects. These obtained results suggest that miR-329 acts as a tumor suppressor (TS) and its reduced expression results in an increase in eEF2K and AXL expressions that lead to progression of TNBC. Moreover, this work also suggests PLL/Ser-SPION as a potential theranostic (therapy+diagnostic) agent with its multifunctional property. Taken all together, this study shows that PLL/Ser-SPIONs-miR 329 system may be a promising and novel miR-therapy strategy against TNBC providing a safe and high antitumor efficacy.Meme kanseri, dünya çapında ikinci en yaygın görülen kanserdir. Üçlü negatif meme kanseri, hastalarda yüksek metastaz, nüks ve mortalite oranına sahiptir ve diğer meme kanseri alt tiplerine kıyasla oldukça agresif bir tiptir. Önemli genetik heterojenliğe sahip olması, östrojen reseptörü, progesteron reseptörü ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 gibi tanımlanmış moleküler hedeflerin bulunmaması nedeniyle, üçlü negatif meme kanseri için etkili bir hedeflenmiş tedavi stratejisi yoktur. Son yıllarda ortaya çıkan kanıtlar, kısa kodlayıcı olmayan mikroRNA'ların (miRNA), hücre döngüsü, proliferasyon, farklılaşma, migrasyon/invazyon ve yaşlanma gibi yolaklarda aktif olan hedef genlerin ekspresyonunu düzenleyerek çeşitli kanser patofizyolojik süreçlerine geniş ölçüde dahil olduklarını ortaya koymuştur. miRNA'lar, hedef mRNA’nın bozunmasını veya translasyonun inhibisyonunu sağlayarak terapötik olarak önemli bir rol kazanır. Bu nedenle miRNA bazlı terapötikler, özellikle üçlü negatif meme kanseri hastaları için yeni bir terapötik yaklaşım olabilir. Bununla birlikte, miRNA'ların klinik çalışmalarda başarılı bir şekilde kullanılabilmesi için güvenli ve verimli salım sistemleri gerekmektedir. Sunulan çalışmada, poli-L-lizin (PLL) ile modifiye edilmiş serisin kaplı süperparamanyetik demir oksit nanopartiküller (SPION’lar) (PLL/Ser-SPIONs’lar) üçlü negatif meme kanseri tedavisi için miRNA salım aracı olarak sentezlendi ve karakterize edildi. PLL/Ser-SPION'lar, + 13 mV olan katyonik zeta potansiyel değerine sahip olarak 25-30 nm boyut aralığında elde edildi. Sentezlenen nanoparçacıklar farklı derişimlerdeki kontrol miRNA ile etkileştirilmiş ve bağlanma verimi aralığı %97-99 olarak bulunmuştur. Transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) ve konfokal mikroskopi analizleri ile miR-kontrol veya kontrol-siRNA yüklü PLL/Ser-SPION'ların üçlü negatif meme kanseri (MDA-MB-231) hücreleri tarafından başarılı bir şekilde hücre içine alındığı ortaya konuldu. miR-329, birkaç miRNA veritabanı analiz edildikten ve üçlü negatif meme kanseri hastalarında aşırı ekspresyonunun yüksek sağkalım oranı ile ilişkili olduğu keşfediltikten sonra hedef miRNA olarak seçildi. Kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ile miR-329'un ekspresyon seviyesinin birçok üçlü negatif meme kanseri hücre hattında önemli derecede düşük olduğu gösterilmiştir. miR-329'un hem üretilen PLL/Ser-SPION'lar hem de ticari bir transfeksiyon reaktifi kullanılarak in vitro olarak verilmesi üçlü negatif meme kanseri hücrelerinde çoğalmayı, invazyonu ve migrasyonu inhibe ettiği ve apoptozu arttırdığı gözlemlenmiştir. miR-329 temelli tedavinin altında yatan moleküler mekanizma, bir dizi hedef tahmin algoritması ile araştırılmış ve miR-329'un, ökaryotik uzama faktörü-2 kinaz (eEF2K) ve AXL genlerinin 3'-UTR'sinde bağlanma bölgelerine sahip olduğu gösterilmiştir. Ek olarak, western blot analizi ile üçlü negatif meme kanseri hücre dizilerinde hem eEF2K hem de AXL'in artmış ekpresyon seviyeleri gözlenmiş ve ayrıca bu genlerin üçlü negatif meme kanseri hastalarında daha kısa genel sağkalım ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Daha da önemlisi, üçlü negatif meme kanseri hücrelerinde miR-329 verilmesinden sonra, hem eEF2K hem de AXL ekpresyonunun önemli ölçüde inhibe edildiği ortaya konmuştur. Üçlü negatif meme kanseri hücreleri ayrıca eEF2K ve AXL’ye spesifik küçük interfere edici RNA'lar (siRNA'lar) ile muamele edilmiş ve bu genlerin susturulması hücre büyümesini ve invazyon/migrasyonu azaltarak miR-329'un ektopik ekspresyonunun etkilerini tekrar etmiştir. Ayrıca, farelerde üçlü negatif meme kanseri ortotopik ksenograft modellerinde (MDA-MB-231 ve MDA-MB-436) miR-329 yüklü PLL/Ser-SPION'ların in vivo olarak uygulanması, tümör büyümesinin önemli derecede inhibisyonuyla sonuçlanmıştır. Western blot analizi ile tümör örneklerinde eEF2K ve AXL seviyelerinin de önemli ölçüde azaldığı gözlenmiştir. Ayrıca, farelerde PLL/Ser-SPIONs-miR-329 tedavisinin saptanabilir yan etkilere neden olmadığı gözlemlenmiştir. Bu bulgular, miR-329'un bir tümör baskılayıcı olarak işlev gördüğünü ve azaltılmış ekspresyonunun, üçlü negatif meme kanserinin ilerlemesine yol açan eEF2K ve AXL ekspresyonlarında bir artışla sonuçlandığını düşündürmektedir. Dahası, bu çalışma PLL/Ser-SPION'u çok fonksiyonlu özelliği ile potansiyel bir theranostik (terapi+teşhis) ajan olarak önermektedir. Sonuçlar hep birlikte ele alındığında, bu çalışma PLL/Ser-SPIONs-miR-329 sisteminin üçlü negatif meme kanserine karşı güvenli ve yüksek bir antitümör etkinliği sağlayan umut verici ve yeni bir miR-terapi stratejisi olabileceğini göstermektedir