High Sensitivity DNA-Based Assays for the Detection of Seafood Species Substitution

Porast potražnje za plodovima mora doveo je do čestih prijevara krivih navođenja podrijetla vrsta u ribolovnoj industriji što potencijalno financijski ili zdravstveno oštećuje potrošača. Uvođenje primjenjive metode za ispitivanje podrijetla vrste uvjetovalo bi smanjenje prijevara u ribolovnoj industriji. U ovom istraživanju ispitivali smo primjenu testova za određivanje vrsta na 15 uzoraka proizvoda plodova mora koji sadrže lignje (red: Chepalophoda) iz kojih je izdvojeno 82 primjerka korištenih u analizama. Potvrđena je mogućnost razlučivanja vrste Loligo vulgaris od ostalih vrsta komercijalno korištenih vrsta liganja računalnim analizama upotrebnom postojećih sljedova nukleotida regije COI iz javnodostupnih baza podataka te sljedova određenih iz referentnih uzoraka liganja vrsta Aloteuthis media i L. vulgaris korištenih u ovom radu. Djelatnici Nacionalnog instituta za biologiju (NIB) su proveli izotermalno umnažanje posredovano petljom (LAMP) specifično za vrstu L. vulgaris koji u trenutnoj fazi istraživanja nije pokazao primjenjivost. Proveli smo određivanje vrsta iz plodova mora upotrebom DNA barkodiranja sekvenciranih PCR produkata na temelju regija COI i 28S. DNA barkodiranja je provedeno formiranjem filogenetskog stabla Maximum likelihood metodom i Kimura 2-parametarskog modela u programu MEGA–X. Zaključujemo veću pouzdanost i primjenjivost regije COI u usporedbi s regijom 28S obzirom na veću uspješnost prilikom sekvenciranja, postojanja većeg broja referentnih sljedova u javnodostupnim bazama te jasnijeg razlučivanja vrsta statističkim analizama. Od 69 uspješno određenih vrsta plodova mora analiziranih u ovom istraživanju postoji 8,70% primjeraka kod kojih je prisutna prijevara zamjene vrsta. Neophodna je metaanaliza s velikim brojem primjeraka na razini cijelog slovenskog tržišta obzirom da su u ovom istraživanju analizirani relativno mali broj uzoraka na temelju kojih je teško procijeniti prisutnost prijevara na cijelom slovenskom tržištu.The increase in seafood demand resulted in frequent seafood frauds such as species mislabeling, which could lead to health risks or financial deprivation of consumers. Applicable assays for species identification would result in seafood fraud prevalence reduction in the fishing industry. In this study, we examined the application of high sensitivity DNA-based assays for the detection of species substitution for 82 specimens isolated from 15 seafood samples containing squid (order: Cephalopoda). Fragments of COI and 28S were used to assess whether commercially important species could be identified using DNA based approach. Pairwise intra- and inter-specific p-distances were assessed to determine the possibility of distinguishing L. Vulgaris from other commercially important squid species. We used COI sequences from publicly available databases and sequences determined from reference samples (A. media and L. Vulgaris species) in this study. Employees of the National Institute of Biology (NIB) performed loop-mediated isothermal amplification (LAMP) specific for L. Vulgaris, which showed no application at the current stage of the study. Phylogenetic analysis was performed as part of DNA barcoding by forming a maximum likelihood tree and a Kimura 2-parameter model in the MEGA–X program. We conclude greater reliability and applicability of the COI region compared to the 28S region, given the higher success in sequencing, the presence of a larger number of reference sequence data in publicly available databases, and a clearer distinction of species using the bootstrap method. Of the 69 successfully identified seafood species analyzed in this study, there are 8.70% of specimens in which species substitution fraud is present. A meta-analysis with a larger number of specimens from the entire Slovenian market is necessary, given that this research analyzed a relatively small number of samples based on which it is difficult to assess the presence of fraud in the entire Slovenian market