Análise do papel do sistema endotelinérgico e endocanabinoide e da neuroinflamação sobre a generalização da memória de medo em ratos sobreviventes de sepse

Orientador(a): Prof. Dr. Aleksander Roberto ZampronioCoorientadora: Profa. Dra. Cristina Aparecida Jark SternDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Defesa : Curitiba, 30/01/2020Inclui referências: p. 60-71Resumo: O Transtorno do Estresse Pós-Traumático (TEPT) é uma doença multifatorial complexa vista em indivíduos que passaram ou testemunharam experiências com alto risco à vida. Ansiedade, depressão, pânico e re-experiência da memória traumática são sintomas comuns nesta doença. A patogênese inclui a formação de uma memória de medo generalizada e prejuízo em funções hipocampais como o padrão de separação, estando relacionada com diversos mecanismos incluindo o sistema endocanabinoide (eCB) e a neuroinflamação. A sepse, doença igualmente complexa que se manifesta como uma falência de órgãos com alto risco a vida e secundária a uma infecção que chega à corrente sanguínea, é capaz de induzir um ambiente neuroinflamatório severo e tem consequências de longo-prazo que incluem déficit cognitivo e o TEPT. Os sistemas endotelinérgico e eCB têm implicações importantes na sepse participando de respostas modulatórias sistema nervoso central (SNC) que medeiam a liberação de vasopressores, parâmetro determinante na hipoperfusão tecidual responsável pela falência de órgãos vista na sepse. Evidências apontam que o bloqueio pontual destes sistemas nas fases iniciais da sepse melhora desfechos como a taxa de sobrevida e a resposta a vasopressores. Também, o sistema eCB participa da modulação da memória em regiões como o hipocampo. Neste estudo avaliamos a hipótese de que o bloqueio destes sistemas na fase inicial da sepse teria implicações na neuroinflamação e, tardiamente, na generalização da memória de medo (um modelo de TEPT). Ratos Wistar machos foram submetidos a Ligação e Perfuração do Ceco (CLP) para indução de sepse e receberam por via intracerebroventricular (i.c.v.) o antagonista de receptores ETA (BQ123), de receptores CB1 (AM251) ou CB2 (AM630) ou ainda um inibidor da ativação de micróglia (minociclina) após 4 h. Foi avaliada a taxa de sobrevida e a hiperalgesia mecânica diariamente até o oitavo dia após a CLP utilizando um analgesímetro eletrônico. No décimo dia, os animais foram submetidos à um protocolo de condicionamento de medo ao contexto para avaliação da generalização da memória de medo contextual. Neste protocolo os animais são submetidos a uma sessão de condicionamento a um estímulo aversivo. Em seguida, o comportamento de congelamento é avaliado como porcentagem em função do tempo total sob exposição primeiramente no mesmo contexto (Teste A1) e em um contexto novo e não pareado com estímulo aversivo (Teste B1). Este último é usado para avaliação da generalização da memória de medo. Os testes foram repetidos na semana seguinte (Teste A2 e B2). Ao final dos experimentos foram coletadas amostras de hipocampo dos animais para dosagem da proteína Arc como marcador para neurogênese. Ainda, avaliamos o efeito dos tratamentos na neuroinflamação ao dosar o fator de necrose tumoral ? (TNF-?) no hipocampo dos animais 4 h após o tratamento, correspondendo a 8 h após a cirurgia, pico de indução de citocinas no SNC. Nossos resultados indicaram que a sepse induzida por CLP é capaz de gerar hiperalgesia mecânica que dura até cinco dias dependendo da severidade associada a sepse. Nos dias subsequentes os animais sham e submetidos a CLp apresentaram limiares mecânicos normais e similares. O condicionamento dos animais foi então inciados e no 13o dia após a cirurgia os animais submetidos à CLP desenvolvem uma generalização da memória de medo o que não ocorreu com os animais falso-operados. Esta generalização permaneceu até o final dos experimentos (20 dias). Também temos evidência de que esta generalização possa estar relacionada a uma maior consolidação da memória de medo nos grupos que passaram por sepse. O bloqueio do receptor ETA 4 h após a indução de sepse aumentou a a taxa de sobrevida, mas não modificou a hiperalgesia nos tempos testados ou a generalização da memória. Por sua vez, o bloqueio do sistema eCB reverteu a generalização da memória sem causar efeitos sobre a hiperalgesia mas apenas o bloqueio CB1 melhorou também a taxa de sobrevida. A inibição da micróglia impediu a generalização da memória e reduziu os níveis de TNF-? no hipocampo, mas não modificou a taxa de sobrevida ou a hiperalgesia. Exceto pela minociclina, nenhum dos outros tratamentos alterou a neuroinflamação induzida pela sepse. Os efeitos observados sobre a memória não envolvem alterações na neurogênese visto que a avaliação da expressão de Arc não foi diferente entre nenhum dos grupos experimentais. Assim, concluímos que o bloqueio ETA e de receptores CB1são estratégias importantes no restabelecimento da taxa de sobrevida associada a sepse, e que o bloqueio eCBe da neuroinflamação podem ser mecanismos viáveis para prevenir consequências tardias como o TEPT. O bloqueio de receptores CB1 durante a fase inicial da sepse parece ser uma estratégia interessante pois mostrou-se efetivo tanto na melhora na taxa de sobrevida quanto nos déficts de memória subsequentes. Palavras-chave: Sepse. Memória. Endocanabinoides. Endotelina. NeuroinflamaçãoAbstract: Post-Traumatic Stress Disorder (PTSD) is a complex multifactorial disease seen in individuals that underwent or witnessed life-threatening experiences. Anxiety, depression, panic and re-experiencing the traumatic memory are common symptoms. The pathogenesis of this disease includes the formation of a generalized fear memory as well as a loss o hippocampal functions, such as loss of pattern separation. These are correlated with an array of mechanisms that include the endocannabinoid (eCB) system and neuroinflammation. Sepsis is a disease as equally as complex that manifests itself as a life-threatening organ failure secondary to an infection that reaches systemic circulation. It induces a severe neuroinflammatory environment and has long-term consequences that include PTSD. The endothelinergic and eCB systems have important roles in sepsis by acting as central modulators of vasopressors release. These are crucial for survival in sepsis as a lack of adequate response to vasopressors and hypotension underlie the pathogenesis of organ failure in sepsis. Evidence shows that timed blockade of these systems in sepsis enhances survival rate and alters the response to vasopressors. Also, the eCB system modulates memory formation in regions such as the hippocampus. In this study we tested the hypothesis that by blocking these systems in early sepsis would have an effect in neuroinflammation and late generalization of fear memory (a model for PTSD). Male rats underwent Cecal Ligation and Puncture (CLP) for sepsis induction. As treatment, we administered the antagonists for either ETA receptors (BQ123), CB1 and CB2 receptors (AM251 and AM630, respectively) or a microglia inhibitor (minocycline) via intracerebroventricular (i.c.v.) injection 4 h after CLP. We evaluated the survival rate and mechanical hyperalgesia every day after surgery for eight days. Mechanical threshold was measured using an electronic algesimeter. On the tenth day after surgery animals underwent a contextual fear conditioning (CMC) protocol that consisted of a familiarization session in a neutral context followed, the next day, by a conditioning session paired with an unconditioned aversive stimulus. Animals were tested on the following day in the same context (Test A1) with freezing response as an index of fear memory. A test in a novel unpaired neutral context was done the next day (Test B1) to evaluate generalization of fear memory as a measure for PTSD-like effect. Both tests were repeated a week after and all animals that underwent these where euthanized for obtaining hippocampus samples for western blot assay of the Arc protein, a marker for neurogenesis. Also, using different animals, we measured the concentration of a neuroinflammation marker, tumor necrosis factor ? (TNF-?), 4 h after i.c.v. treatment, during sepsis-induced peak levels of cytokine expression in the central nervous system (CNS). Our results indicate that sepsis induced by CLP can generate mechanical hyperalgesia that lasts for up to five days depending on the severity associated with the procedure. After this period, all animals have similar mechanical threshold response. We also show that 13 days after CLP, conditioned animals express a generalized fear memory that lasts for up to 20 days, an effect not seen in sham-operated animals. Our evidence also points a possible mechanism underlying a more consolidated fear memory. Regarding treatments, blocking the ETA receptors 4 h after sepsis increased the survival rate but had no effects in hyperalgesia, generalization of fear memory or neuroinflammation. On the other hand, blockade of eCB receptors reversed the generalization of fear memory, also not affecting mechanical hyperalgesia nor neuroinflammation, and only CB1 receptor blockade reversed the generalization of fear memory. Microglial inhibition in early sepsis lowered TNF-? levels in the hippocampus and late generalization of fear memory, without affecting survival rate or mechanical hyperalgesia. The observed effects in generalization of fear memory do not seem to be related with neurogenesis, as none of the treatments had any impact on Arc expression in the dorsal hippocampus regardless of treatment group or whether the group underwent CLP. Altogether the results show that blockade of ETA receptors might be a strategy for better mortalityassociated outcomes in sepsis. Also, eCB blockade and neuroinflammation inhibition are viable mechanisms to prevent late consequences of sepsis, such as PTSD. We highlight the CB1 receptor blockade in this regard, as it also enhances survival rate. Keywords: Memory. Sepsis. Endocannabinoid. Endothelin. Neuroinflammatio