Proteção contra os efeitos tóxicos do veneno de aranhas do gênero Loxosceles utilizando fosfolipases-D mutadas recombinantes como antígeno

Orientadora: Profa. Dra. Luiza Helena GremskiCoorientador: Prof. Dr. Silvio Sanches VeigaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 02/04/2020Inclui referências: p. 87-97Resumo: O envenenamento por aranhas do gênero Loxosceles, popularmente conhecidas como aranhas marrons, é um problema de saúde pública em muitas regiões do Brasil, onde foram notificados 7.992 casos e 9 óbitos no ano de 2017. As espécies mais comumente envolvidas em acidentes no Brasil são L. intermedia, L. gaucho e L. laeta. O loxoscelismo é uma síndrome necrótica-hemolítica causada pela picada de aranha marrom, que, em casos raros, pode levar ao óbito. O veneno de Loxosceles é formado por uma mistura complexa de toxinas, e é rico em proteínas, enzimas e peptídeos. Entre essas enzimas destacam-se as fosfolipases-D (FLD), ou toxinas dermonecróticas; sozinhas elas podem reproduzir experimentalmente a maioria dos sintomas do loxoscelismo. Apesar de os acidentes com aranhas marrons serem um problema de saúde pública, uma terapia definitiva ainda não foi estabelecida. A soroterapia heteróloga ainda é o método que apresenta o maior potencial terapêutico, porém, por diversos fatores, ainda é uma terapia muito limitada, não é isenta de riscos, é de difícil obtenção e causa sofrimento ao animal produtor do soro. Tendo em vista a necessidade de se pensar em métodos alternativos aos já existentes uma estratégia preventiva poderia ser aplicada em regiões onde o loxoscelismo é endêmico, em pessoas que já utilizaram qualquer soro heterólogo de origem equina ou em pacientes não elegíveis para a soroterapia. Portanto, este projeto teve como objetivo o uso de FLDs mutadas recombinantes como imunógenos de um composto vacinal capaz de proteger coelhos e camundongos frente ao veneno das espécies de Loxosceles. As proteínas mutadas recombinantes escolhidas como antígenos para a formulação vacinal (Y228A L. intermedia, E32A/D34A L. gaucho e H12A/H47A L. laeta) apresentaram alto potencial imunogênico, perda da atividade esfingomielinásica e da capacidade de desenvolver dermonecrose. Na sequência, foram realizados testes para avaliar o efeito protetivo promovido por esses antígenos frente ao veneno loxoscélico. Coelhos vacinados com diferentes formulações vacinais foram desafiados com os venenos loxoscélicos em ensaios de dermonecrose e avaliações hematológicas e bioquímicas foram realizadas. Foram observadas reduções expressivas em eritema, equimose e dermonecrose nos animais vacinados em relação aos animais não vacinados (controles negativo). A vacinação foi capaz de causar reduções de até 95% em edema. Parâmetros hematológicos indicaram uma grande produção de linfócitos nos animais vacinados após o desafio com os venenos loxoscélicos, indicando uma resposta imunológica. Ainda, parâmetros bioquímicos não indicaram sinais contundentes de danos renais e hepáticos causados pelos venenos, nem nos animais controle negativo. O efeito protetivo da vacinação frente aos danos sistêmicos do envenenamento foi mais bem avaliado em camundongos. A vacinação nesses animais promoveu 79% de proteção frente à letalidade causada pelo veneno de L. intermedia em 72 horas. No mesmo tempo, camundongos controle negativo apresentaram 100% de letalidade. Os resultados obtidos no presente estudo comprovam a eficácia e segurança no uso de FLDs mutadas recombinantes como antígenos. Isso ressalta o potencial dessas moléculas como bioferramentas para o desenvolvimento de novos tratamentos para o loxoscelismo, como vacinação ou soroterapia de segunda geração. Palavras-chave: Loxosceles. Fosfolipase-D. Vacina.Abstract: Envenomation by Loxosceles spiders, popularly known as brown spiders, is a public health problem in many regions of Brazil, where 7,992 cases and 9 deaths were reported in 2017. The species most commonly involved in accidents in Brazil are L. intermedia, L. gaucho and L. laeta. Loxoscelism is a necrotic-hemolytic syndrome triggered by the brown spider bite, which, in rare cases, can lead to death. Loxosceles' venom consists of a complex mixture of toxins enriched in proteins, enzymes and peptides. However, phospholipases-D (PLD), or dermonecrotic toxins, can be considered the most important toxin of this venom, since they can reproduce experimentally the majority of symptoms of loxoscelism. A definitive therapy is not yet established. Serum therapy is the method that has the greatest therapeutic potential; however, it is still very limited. It is not risk-free, difficult to obtain and causes animal suffering during the production. In attempt to establish new methods, a preventive strategy could be applied in areas where loxoscelism is endemic, in people who had already used any heterologous serum of equine origin, as well as in people not eligible to use serum therapy. In this context, this work proposes the use of recombinant mutated PLDs as antigens in a vaccine capable to protect rabbits and mice from the action of Loxosceles venom. The recombinant mutated PLDs chosen as antigens (LiRec Y228A, LgRec E32A/D34A and LlRec H12A/H47A) showed a high immunogenic potential, lost their capacity to hydrolyze sphingomyelin and to develop dermonecrosis. Then these proteins were used to evaluate if they were able to elicit some protective response against Loxosceles venom. For this, rabbits were administered with different vaccine formulations and then challenged with whole venom. Hematological and biochemical parameters were also evaluated. Reductions of up to 95% in edema and a significant decrease in erythema, bruise and dermonecrosis were observed in vaccinated animals when compared to negative control animals. Hematological findings showed a large production of lymphocytes in vaccinated animals after the challenge with Loxosceles venom, suggesting a stimulation of immune system. In addition, biochemical parameters did not indicate strong signs of kidney and liver damage caused by envenomation, even in negative control animals. The systemic damage induced by the venom was better evaluated in mice. Vaccination in these animals provided 79% of protection against the lethality caused by the L. intermedia venom in 72 hours. At the same time, negative control mice showed 100% lethality. Results showed in the present study evidence the efficacy and safety of using recombinant mutated PLDs as antigens. This highlights the potential of these molecules as bio tools for development of new treatments for loxoscelism, such as vaccines or second-generation serum therapy. Keywords: Loxosceles. Phospholipase-D. Vaccine