Avaliação dos efeitos biológicos das frações do látex de Euphorbia umbellata Pax Bruyns e do triterpeno eufol : no sistema complemento, quimiotaxia de neutrófilos e toxicidade celular

Orientador: Profa. Dra. Iara José de Messias-ReasonCoorientador: Prof. Dr. Flávio Luís BeltrameTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa : Curitiba, 13/12/2019Inclui referências: p. 99-112Área de concentração: Análises ClínicasResumo: O sistema complemento desempenha um importante papel na imunidade humoral e inata e pode ser ativado por três vias: clássica (VC), alternativa (VA) e lectina (VL). Essas vias são ativadas por diferentes mecanismos que culminam em uma cascata proteolítica que elimina microrganismos e desencadeia o processo inflamatório. Sua ativação exacerbada está relacionada a reações autoimunes, doenças inflamatórias, promoção de crescimento tumoral e metástase. A espécie Euphorbia umbellata Pax Bruyns tem sido tradicionalmente utilizada para o tratamento de doenças inflamatórias e câncer. Suas atividades biológicas são atribuídas aos constituintes químicos presentes em sua composição como terpenos, alcaloides e flavonoides. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito das frações hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol do látex de E. umbellata e do composto majoritário presente nesta matriz, eufol, sobre a ativação das vias do sistema complemento e na quimiotaxia de neutrófilos, bem como, a atividade do eufol em cultura de células HRT18, B16F10 e 3T3 e seus possíveis mecanismos de indução de morte celular. A avaliação do complemento foi realizada utilizando ensaios hemolíticos para VC e VA e ELISA para VL, e, a quimiotaxia de neutrófilos, foi realizada utilizando a caseína como indutor quimiotático e câmara de Boyden. A citotoxicidade foi avaliada pelas metodologias de redução do MTT, internalização do vermelho neutro pelos lisossomos, cálculo do IC50 e índice de seletividade. Os mecanismos de morte celular foram avaliados pela morfologia celular à fresco e com coloração hematológica; e o ciclo celular e potencial transmembrânico de mitocôndria através de citometria de fluxo. Todas as frações do látex de E. umbellata e eufol induziram um efeito inibitório na ativação da VA. Na VC as frações metanol e acetato de etila inibiram a ativação, e os extratos clorofórmio e o eufol ativaram esta via. A VL foi inibida pela fração hexano, acetato de etila e eufol. A quimiotaxia de neutrófilos foi inibida por todas as frações do látex e pelo eufol. O eufol também foi capaz de induzir morte celular pelas duas metodologias de citotoxicidade avaliadas, no entanto a técnica de internalização do vermelho neutro foi mais sensível. Os valores de IC50 foram 62,7+7,6, 70,7+4,3, 39,0+6,5 ?M para B16F10, HRT18 e 3T3, respectivamente, e o índice de seletividade 0,62 e 0,55 para B16F10 e HRT18. A morfologia das células tratadas com eufol mostraram sinais de morte apoptótica tanto na visualização à fresco quanto com coloração hematológica. Já as análises das fases do ciclo celular e do potencial transmembrânico de mitocôndria não mostraram alterações quando comparadas ao grupo controle. Assim, é possível concluir que o fitocomplexo e o eufol isolado das frações de látex de E. umbellata têm potencial para uso no tratamento de doenças inflamatórias relacionadas ao complemento e possível aplicação na terapia do câncer. Palavras chave: Euphorbia umbellata. Eufol. Sistema complemento. Quimiotaxia. Citotoxicidade.Abstract: The complement system plays an important role in humoral and innate immunity and can be activated by three pathways: classical (CP), alternative (AP) and lectin (LP). These pathways are activated by different mechanisms that culminate in a proteolytic cascade that eliminates microorganisms and triggers the inflammatory process. Its exacerbated activation is related to autoimmune reactions, inflammatory diseases, tumor growth promotion and metastasis. The species Euphorbia umbellata Pax Bruyns has been traditionally used for the treatment of inflammatory diseases and cancer. Its biological activities are attributed to the chemical constituents present in its composition as terpenes, alkaloids and flavonoids. The aim of this work was to evaluate the effect of hexane, chloroform, ethyl acetate and methanol fractions of E. umbellata latex and the major compound present in this matrix, euphol, on the activation of complement system pathways and neutrophil chemotaxis, as well as the euphol activity in HRT18, B16F10 and 3T3 cell culture and their possible mechanisms of cell death induction. Assessment of complement by CP and AP pathways was performed using hemolytic and ELISA assays for LP and neutrophil chemotaxis was performed using casein as the chemotactic inducer and Boyden's chamber. Cytotoxicity was evaluated by MTT reduction and neutral red internalization by lysosomes methodologies, IC50 calculation and selectivity index. The mechanisms of cell death were evaluated by fresh and hematologically stained cell morphology; and the cell cycle and transmembrane potential of mitochondria by flow cytometry. All latex fractions of E. umbellata and euphol induced an inhibitory effect on AP activation. In CP, methanol and ethyl acetate fractions inhibited activation, and chloroform and euphol extracts activated this pathway. LP was inhibited by the hexane, ethyl acetate and euphol fraction. Neutrophil chemotaxis was inhibited by all latex fractions and euphol. Euphol was also able to induce cell death by the two cytotoxicity methodologies evaluated, however the neutral red internalization technique was more sensitive. IC50 values were 62.7+7.6, 70.7+4.3, 39.0+6.5 ?M for B16F10, HRT18 and 3T3, respectively, and the selectivity index 0.62 and 0.55 for B16F10 and HRT18. The morphology of the euphol treated cells showed signs of apoptotic death in both fresh visualization and hematological staining. Cell cycle phase and mitochondrial transmembrane potential analyzes showed no changes when compared to the control group. Thus, it can be concluded that phytocomplex and euphol isolated from E. umbellata latex fractions have potential for use in the treatment of complement-related inflammatory diseases and possible application in cancer therapy. Keywords: Euphorbia umbellata. Euphol. Complement system. Chemotaxis. Cytotoxicit