Anaerobic oxidation of methane in paddy soil

Die anaerobe Oxidation von Methan (AOM) ist eine wichtige globale CH4-Senke, die potenzielle CH4-Emission in die Atmosphäre ausgleicht. Es wird geschätzt, dass die AOM bis zu 90% des in marinen Sedimenten produzierten CH4 verbraucht, bevor es in die Atmosphäre gelangt. In terrestrischen Ökosystemen ist die AOM hingegen eine unzureichend erforschte CH4-Senke. Die spezifischen Mechanismen der terrestrischen AOM sind weitgehend unbekannt; ebenso fehlt eine Abschätzung der ökologischen Relevanz der AOM als CH4-Senke, insbesondere in Ökosystemen, die lang anhaltenden anaeroben Bedingungen ausgesetzt sind, wie z.B. Reisfelder. Überflutete Reisfeldböden sind Hotspots der Methanogenese, gleichzeitig aber verfügen sie potenziell große Mengen alternativer Elektronenakzeptoren (AEAs), die von methanotrophen Mikroorganismen benötigt werden um CH4 anaerob zu oxidieren. Die Rolle individueller AEAs und die Intensität des AOM-Prozesses bei der Kompensation der CH4-Flüsse aus Reisfeldern sind bislang jedoch unklar. Darüber hinaus bleibt unklar, wie verschiedene AEAs aus unterschiedlichen Düngemitteln die anaeroben mikrobiellen Interaktionen beeinflussen, und ob ein bevorzugter AOM-Pfad aus diesen Interaktionen resultiert. Aktuelle Studien zur AOM basieren weitgehend auf Mikrokosmos-Inkubationen mit Headspace-CH4-Injektion und Schütteln. Während das Schütteln einerseits zu mechanischen Störungen führt, kann der Verzicht auf das Schütteln aufgrund der relativ geringen CH4-Löslichkeit zu einer systematischen Unterschätzung der CH4-Oxidation führen. Zur Lösung dieser analytischen Probleme und zur Beantwortung der oben genannten Forschungsfragen wurden vier Aspekte in dieser Studie untersucht: (i) Nutzen der Silikonschlauch-Methode für die Bestimmung der CH4-Oxidation, (ii) Bestimmung der AOM unter Schütteln gegenüber stationären Bedingungen mit Silikonschläuchen, (iii) Rolle der AEAs und der applizierten Düngemittel für die AOM, (iv) aktive AOM-Pfade in Abhängigkeit von der mikrobiellen Gemeinschaft in Reisböden. Diese Aspekte wurden durch die Verfolgung von 13C-Markierungen aus CH4 in CO2, organische Bodensubstanz, mikrobielle Biomasse und Phospholipid-Fettsäuren (PLFA) in gedüngten (Schweinemist, Biokohle, NPK) Reisböden untersucht, die mit alternativen Elektronenakzeptoren (NO3-, Fe3+, SO42-, Huminsäuren) ergänzt wurden. Die CH4-Oxidation wurde quantifizieret und beteiligte mikrobiellen Gruppen wurden durch 16S rRNA-Sequenzanalysen identifiziert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Injektion von CH4 über poröse Silikonschläuche direkt in den Reisboden die schlechte Löslichkeit von CH4 ausgleichen kann und somit die übliche Schüttelmethode durch diese ersetzt werden kann. Mit dieser Methode betrug die höchste Netto-Oxidationsrate von CH4 während einer 29-tägigen Inkubation 1,6 µg C-CO2 g-1 trockener Boden pro Stunde. Dies war 1,5-2,5-mal schneller als die entsprechende CH4-Oxidation nach Headspace-Injektion ohne Schütteln. Die CH4-Oxidationsraten von Injektionen mit Silikonschlauch ohne Schütteln und Headspace-Injektionen mit Schütteln waren ähnlich. Folglich kann der Silikonschlauchansatz die übliche Schüttelmethode ersetzen. Da die Gaskonzentrationsgradienten erhalten bleiben, werden die natürlichen Bodenbedingungen mit dieser Methode deutlich realistischer wiedergeben. Das Auftreten der AOM in Reisböden konnte anhand der 13C-Anreicherung von CO2 nach 13CH4-Injektion während einer 59-tägigen anaeroben Inkubation eindeutig bestätigt werden. Die kumulative AOM erreichte ohne Schütteln 0,16-0,24 μg C-CO2 g-1 trockenen Boden, mit Schütteln war sie 33-80% niedriger. Unerwarteterweise war bei Verwendung von Silikonschläuchen der Effekt des Schüttelns unbedeutend, was darauf hindeutet, dass der wichtigste limitierende Faktor für die AOM nicht die CH4-Konzentration in der Wasser-Boden-Suspension sondern die Verfügbarkeit von AEAs war. Ohne Schütteln zeigte die Kontrolle (keine CH4-Zugabe) einen stetigen Anstieg der CH4-Konzentration im Headspace/Schlauch durch Methanogenese, während sie mit Schütteln während 59 Tagen konstant niedrig blieb. Dies deutet darauf hin, dass Schütteln die Methanogenese hemmte, möglicherweise durch die Störung der Co-Lokalisierung zwischen AOM-verwandten Mikroorganismen untereinander, und ihren Substraten (d.h. CH4 und AEAs). NO3- erwies sich während der 84-tägigen anaeroben Inkubation als der wirksamste Elektronenakzeptor. Die höchste AOM-Rate betrug 0,80 ng C g-1 TB h-1 unter Schweinemistdüngung, gefolgt von der Kontrolle, NPK, und Biokohle. Die Rolle von Fe3+ bei AOM blieb unklar. SO42- hemmte AOM, stimulierte aber stark die Produktion von unmarkiertem CO2, was auf eine intensive sulfatinduzierte Zersetzung von organischem Material hinweist. Nach NO3- waren Huminsäuren der zweitwirksamste Elektronenakzeptor für die AOM, erhöhten jedoch gleichzeitig die Methanogenese bei allen Düngungsbehandlungen um das 5-6-fache. Wir konnten zum ersten Mal zeigen, dass organische Elektronenakzeptoren zu den wichtigsten AOM-Treibern gehören und in Reisböden von entscheidender Bedeutung sind. Schließlich wurden mittels nachverfolgung der 13C-Inkorporation von 13CH4 in die mikrobielle Biomasse und PLFA die wichtigsten AOM-Pfade untersucht, und Verbindungen zwischen diesen Pfaden und dem Netzwerk der mikrobiellen Gemeinschaft hergestellt. Das Co-occurrence Network zeigte eine Reihe von Haupt- und Neben-AOM-Pfaden mit synergistischen Beziehungen zu komplementären anaeroben mikrobiellen Gruppen. Eine Reihe vergleichender Analysen bestätigte, dass die NO3--getriebene AOM der Hauptpfad der AOM war. Sie interagierte mit mehreren Nebenpfaden, insbesondere der NO2- Reduktion durch NC10-Bakterien, die Reduktion Fe3+ und (mutmaßlich) Huminsäuren durch Geobacter-Arten, sowie die SO42- Reduktion durch sulfatreduzierende Bakterien in Verbindung mit anaeroben Methanotrophen. Schätzungsweise hat die NO3--induzierte AOM unter Schweinemistdüngung das Potential, jährlich ~3,9 Tg C-CH4 zu recyceln, was etwa ~10-20% der globalen Netto-CH4-Emissionen von Reisfeldern ausgleicht. Geeignete organische und mineralische Düngestrategien bieten daher einen wirksamen Hebel zur Reduktion von CH4-Emissionen aus unter Nassanbau bewirtschafteten Agrarökosystemen.The anaerobic oxidation of methane (AOM) is a globally important CH4 sink that offsets potential CH4 emission into the atmosphere. AOM is estimated to consume up to 90% of CH4 produced in marine sediments before it reaches atmosphere, but it is an underappreciated CH4 sink in terrestrial ecosystems. This calls for the study of the specific mechanisms of terrestrial AOM and the estimation of the ecological relevance for CH4 sink, especially in ecosystems exposed to long-term anaerobic conditions such as rice paddies. Flooded paddy soils are the hotspot area of methanogenesis along with a high availability of alternative electron acceptors (AEAs) needed by methanotrophic microorganisms to oxidize CH4 anaerobically. However, the role of AEAs and the intensity of the AOM process in reducing the CH4 fluxes from rice paddies remain unclear. Moreover, it remains unclear how AEAs from different fertilization modes affect anaerobic microbial interactions, and whether a preferred AOM pathway exists in these interactions. Current studies on AOM are largely based on microcosm incubations with headspace CH4 injection and shaking. However, shaking introduces mechanical disturbances but the lack of shaking may lead to a systematical underestimation of CH4 oxidation due to the relatively low solubility of CH4. To address these and the above challenges, four research aspects were investigated in this: (i) utility of the silicone tube approach for CH4 oxidation studies, (ii) the occurrence of AOM under shaking and steady conditions with silicone tubes, (iii) role of AEAs and fertilization for AOM, (iv) active AOM pathways and functioning of the microbial community network in paddy soils. These aspects were investigated by tracing the 13C-label from CH4 into CO2, soil organic matter, total microbial biomass and phospholipid fatty acids (PLFA) in fertilized (manure, biochar, NPK) paddy soils amended with alternative electron acceptors (NO3-, Fe3+, SO42-, humic-acids) to quantify CH4 oxidation, and identify microbial groups by 16S rRNA sequencing analyses. Our results implied the injection of CH4 belowground via porous silicone tubes to compensate for the poor solubility of CH4 and replace the common shaking method. During a 29-day incubation of soil slurry, the highest net CH4 oxidation rate was 1.6 µg C-CO2 g-1 dry soil h-1 after injecting 13CH4 into the slurry through a silicone tube without shaking. This was 1.5-2.5 times faster than the respective CH4 oxidation after headspace injection without shaking. Furthermore, it was found that CH4 oxidation rates were similar between silicone tube injection without shaking and headspace injection with shaking. Consequently, the silicone tube approach can substitute the common shaking method. As the silicone tube approach maintains the gas concentration gradients, it can more realistically reflect natural soil conditions. Secondly, by 13C enrichment of CO2 after 13CH4 injection we clearly confirmed the hypothesized occurrence of AOM in paddy soil during a 59-day anaerobic incubation. The cumulative AOM reached 0.16-0.24 μg C-CO2 g-1 dry soil without shaking, but it was 33-80% lower with shaking. Unexpectedly, the effect of silicone tubes on AOM was insignificant either with or without shaking, suggesting that the main limiting factor for AOM was not the CH4 concentration in water (slurry) but the availability of AEAs. Without shaking, the methanogenesis control (no CH4 addition) revealed a steady increase of CH4 in the headspace/tube, whereas the CH4 concentration in jars with shaking was constantly low during 59 days. This suggests that shaking inhibited methanogenesis, possibly by disturbing the AOM-related microorganisms which were co-localized to the substrates (i.e. CH4 and AEAs). Added NO3- was the most effective electron acceptor during 84 days of anaerobic incubation. The highest AOM rate was 0.80 ng C g-1 dry soil h-1 under pig manure fertilization followed by the control and NPK, while AOM was the lowest under biochar application. The role of Fe3+ in AOM remained unclear. SO42- inhibited AOM but strongly stimulated the production of unlabeled CO2, indicating intensive sulfate-induced decomposition of native organic matter. Added humic acids were the second most effective electron acceptor for AOM, but increased methanogenesis by 5-6 times in all fertilization treatments. We demonstrated for the first time that organic electron acceptors are among the key AOM drivers and are crucial in paddy soils. Finally, we determined AOM pathways by tracing 13C incorporation from 13CH4 into total microbial biomass and PLFA, and related these pathways to the microbial community’s network. The co-occurrence network revealed a set of major and minor AOM pathways with synergistic relations between complementary anaerobic microbial groups. A set of comparative analyses confirmed that NO3--driven AOM was the major AOM pathway. It co-existed with minor pathways involving NO2- reduction by NC10 bacteria, putative reduction of humic acids and Fe3+ by Geobacter species, and SO42- reduction by sulfate-reducing bacteria linked with anaerobic methanotrophs. In a broader ecological view, AOM is ubiquitous in paddy soils but still is an underappreciated CH4 sink. NO3--induced AOM together with manure fertilization has the potential to recycle ~3.9 Tg C-CH4 annually before the produced CH4 released to the atomsphere, which was equivalent to roughly ~10–20% of the global net CH4 emissions from rice paddies. Consequently, the application of suitable organic and mineral fertilization strategies can provide an effective control on the CH4 sink under anaerobic conditions in submerged agricultural ecosystems