Synthese von D-Phe/D-DiPhe-Pro-basierenden Liganden und deren biophysikalischen Charakterisierung zur Selektivitätsstudie von Thrombin und Trypsin sowie ein synthetischer Beitrag zur Darstellung von Inhibitoren der Aldose-Reduktase und Carboanhydrase II

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit (Kapitel 1-7) wird ein Syntheseprojekt einer kongenerischen Serie von D-Phe/D-DiPhe-Pro-basierenden Inhibitoren für Thrombin und Trypsin sowie deren biophysikalischen Charakterisierung vorgestellt. Beide Proteine sind strukturell hochgradig verwandte Serinproteasen, die Unterschiede in ihrer Substraterkennung aufweisen. Thrombin ist Arg-spezifisch, während Trypsin Peptidketten nach Lys und Arg spaltet. Sie erkennen die basischen Substratkopfgruppen über Asp189, das sich am Boden der S1-Tasche befindet. Die synthetisierten Inhibitoren werden sowohl kristallographisch für beide Serinproteasen analysiert als auch thermodynamisch über isothermale Titrationskalorimetrie (ITC) untersucht, um ihre Bindungseigenschaften in der S1-Tasche zu beschreiben und zu vergleichen. Ein enzymkinetischer Fluoreszenzassay unterstützt zudem die biophysikalische Charakterisierung dieser Verbindungen gegenüber beiden Proteinen. Insbesondere steht dabei die Untersuchung von Protonierungseffekten in der S1-Tasche im Vordergrund, um die Selektivitätseigenschaften von Thrombin und Trypsin genauer aufzuklären. Obwohl beide Proteasen eine sehr ähnlich aufgebaute S1-Tasche haben, deuten die Ergebnisse auf einen Unterschied in den elektrostatischen Eigenschaften von Asp189 hin, welcher mit der Substratselektivität korrelieren könnte. Es ist überraschend, dass ein Ligand aus dieser Serie im protonierten Zustand mit seiner P1-Kopfgruppe an Trypsin bindet, während dieser im Komplex mit Thrombin unprotoniert bleibt. Für diesen Liganden wird ein leichter Unterschied bezüglich seiner Solvatationsmerkmale beobachtet. Unsere Daten zeigen, dass diese Unterschiede durch die spezifische Natriumbindestelle verursacht werden können, die nur in Thrombin vorhanden ist, aber in Trypsin fehlt. Während die Unterschiede außerdem durch das geladene Glu192 am Rand der S1-Tasche in Thrombin ausgeprägt werden können, werden sie durch das ungeladene Gln192 in Trypsin nicht beeinflusst. Dabei spielt die Berücksichtigung der verschiedenen pKa-Werte der beteiligten funktionellen Gruppen ebenfalls eine wesentliche Rolle. Weiterhin werden in diesem Teil verschiedene Fragmente sowie D-Phe-Pro-Derivate im Komplex mit beiden Proteinen vorgestellt, deren Bindungseigenschaften in der S1-Tasche charakterisiert und verglichen werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit (Kapitel 8-12) wird die Synthese von Aldose-Reduktase-Inhibitoren mit einem 2-Arylcarbamoylphenoxyessigsäure-Gerüst durch die Einführung von verschiedenen Benzylgruppen mit m-ständigen elektronenziehenden Gruppen (hier: Sulfoxid und Boronsäure) vorgestellt. Sie dienen zur Untersuchung der transienten Spezifitätstasche in der Aldose-Reduktase. Elektronenarme aromatische Systeme können eine Öffnung der Spezifitätstasche auslösen und zu bevorzugten Wechselwirkungen mit Trp111 führen. Um den Öffnungsmechanismus dieser transienten Bindetasche genauer zu verstehen, sollten diese synthetisierten Verbindungen auch in verschiedenen Mutationsstudien eingesetzt werden. Unsere ersten kristallographischen Ergebnisse sowie ITC-Experimente zeigen bisher keine eindeutige Interpretation dieses Mechanismus. Unterschiedliche Desolvatationseigenschaften der Inhibitoren können einen Einfluss auf den Mechanismus haben. Der dritte Teil dieser Arbeit (Kapitel 13-17) präsentiert eine weitere synthetische Untersuchung einer Serie von p-alkylierten Benzensulfonamiden und deren Etherderivaten als humane Carboanhydrase II (hCAII)-Inhibitoren, die schrittweise in ihrer Alkylkettenlänge variiert wurden. Während die Sulfonamidgruppe anionisch an Zn2+ bindet, adressiert die aliphatische Alkylkette die hydrophobe Tasche im aktiven Zentrum. Die Bindungsprozesse dieser Verbindungen an diesem Protein wurden kristallographisch, kinetisch und thermodynamisch über ITC analysiert. Es konnten Konformationsänderungen festgestellt werden, deren Effekte die Bedeutung der Formkomplementarität für die Struktur-Bindungsbeziehung aufdecken. Zusätzlich wird in diesem Teil die Synthese von perfluorierten Derivaten vorgestellt, die ein anderes Bindungsmuster in hCAII aufweisen. Sowohl eine kinetische als auch thermodynamische Untersuchung wurde ebenfalls analog zur Studie der nicht-fluorierten Serie durchgeführt. Die Acidität der Sulfonamidgruppe ist durch die stark elektronenziehenden Effekte der Fluorsubstituenten beeinflusst, die vermutlich zum unterschiedlichen Bindungsverhalten des aromatischen Systems im aktiven Zentrum des Proteins führen