Erros inatos do metabolismo da frutose : análise genética de pacientes brasileiros com intolerância hereditária à frutose e deficiência de frutose-1,6-bifosfatase

Introdução: A frutose é um monossacarídeo disponível de forma livre ou integrado à molécula de sacarose, sendo produzida endogenamente a partir do sorbitol pela sorbitol desidrogenase. O metabolismo desse açúcar é realizado por três enzimas: 1) a frutoquinase catalisa a primeira reação na rota, a fosforilação à frutose-1P; 2) a aldolase B (no fígado, intestino e rins) converte essa molécula em duas trioses (diidróxiacetona-P e gliceraldeído); 3) a frutose-1,6-bifosfatase hidrolisa a frutose-1,6-bifosfato em frutose-6P. São descritos três erros inatos, todos de herança autossômica recessiva, envolvendo o metabolismo da frutose: frutosúria essencial (FE), intolerância hereditária à frutose (IHF) e deficiência de frutose- 1,6-bifosfatase (DFB). A FE é assintomática. A IHF é causada por variantes patogênicas no gene ALDOB que resultam em uma aldolase B deficiente. A DFB é consequência de alterações patogênicas no gene FBP1. Atualmente, o principal método diagnóstico da IHF e da DFB é a análise dos genes ALDOB e FBP1, respectivamente. Ambas as doenças ocasionam hipoglicemia e são tratadas por uma dieta restrita em frutose, sendo que na DFB é indicado o consumo de amido de milho cru, para auxiliar na manutenção da normoglicemia. Objetivo principal: caracterizar o perfil genético de pacientes brasileiros com IHF e DFB. Objetivos específicos: I. Relacionar as recentes descobertas envolvendo o metabolismo da frutose e a influência dessas no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para IHF e doença hepática gordurosa não-alcoólica (DHGNA); II. Analisar a distribuição mundial das variantes patogênicas mais frequentes em ALDOB; III. Analisar a frequência de variantes patogênicas e/ou preditas como tal no gene ALDOB no gnomAD e estimar a prevalência de IHF a partir da frequência de heterozigotos para essas variantes; IV. Analisar o perfil genético de pacientes brasileiros com IHF relacionando as variantes patogênicas detectadas com a região geográfica do país; V. Desenvolver um algoritmo para o diagnóstico genético de pacientes brasileiros com IHF; VI. Identificar as variantes evolvidas com a patogênese de DFB em pacientes brasileiros; VII. Caracterizar por abordagens in silico variantes detectadas no gene FBP1; VIII. Realizar a análise funcional in vitro de variantes novas em FBP1 detectadas em pacientes brasileiros. Metodologia: O estudo foi realizado em etapas. Etapa 1: foi realizada uma revisão narrativa e sistemática acerca dos aspectos moleculares da IHF. Etapa 2: o perfil genético de pacientes brasileiros com suspeita clínica ou diagnóstico de IHF (n=22) foi determinado por sequenciamento massivo paralelo. A partir disso, foi desenvolvido um algoritmo para o diagnóstico genético de pacientes brasileiros com IHF. Etapa 3: análise genética de pacientes brasileiros com DFB (n=7) por sequenciamento massivo paralelo e/ou sequenciamento automatizado de Sanger. Variantes patogênicas detectadas em FBP1 foram caracterizadas por análises in silico. Etapa 4: análise funcional das variantes c.472C>T, c.958G>A e c.986T>C detectadas em FBP1. Resultados: Etapa 1: a revisão da literatura evidenciou que as variantes p.Ala150Pro, p.Ala175Asp e p.Asn120Lysfs*32 respondem por ~70% dos alelos patogênicos identificados em pacientes de diferentes etnias. Essas variantes apresentam padrões específicos de distribuição os quais dão indícios de suas prováveis origens. Além disso, foi realizada a análise da prevalência de IHF a partir da frequência de heterozigotos com variantes patogênicas descritos no gnomAD. Os resultados mostram que a prevalência estimada de IHF varia entre as populações, sendo a maior prevalência observada em europeus não finlandeses (1/26.817). Etapa 2: a análise de pacientes brasileiros evidenciou quatro variantes envolvidas na patogênese de IHF: c.178C>T (p.Arg60Ter), 13 c.360_363delCAAA (p.Asn120Lysfs), c.448G>C (p.Ala150Pro) e c.524C>A (p.Ala175Asp). Observa-se que o padrão de distribuição desses alelos varia de acordo com a região geográfica do país. Assim, a variante mais frequente em pacientes do Sul é a p.Ala150Pro, enquanto que em Minas Gerais é a p.Arg60Ter. A partir das análises realizadas foi desenvolvido um algoritmo para o diagnóstico molecular de IHF em pacientes brasileiros, de modo que a análise direcionada para a detecção dos alelos mais frequentes nessa população resulta em uma taxa de diagnóstico de ~100%. Etapa 3: as análises do gene FBP1 detectaram três variantes patogênicas em pacientes do Rio Grande do Sul (n=6): c.472C>T (p.Arg158Trp); c.958G>A (p.Gly320Arg) e c.986T>C (p.Leu329Pro). Sendo que os dois últimos alelos não haviam sido descritos na literatura até então. Análises in silico não evidenciaram alterações estruturais na proteína que indicassem a patogenicidade desses alelos. Além disso, a análise de uma paciente de Alagoas, filha de pais consanguíneos, evidenciou a presença da variante c.611_614delAAAA (p.Lys204Argfs*72) em homozigose. Análises computacionais mostraram que a perda de sítios de ligação ao substrato e de modificações pós-traducionais, além do aumento da desordem na estrutura da proteína são indícios da patogenicidade desse alelo. Etapa 4: o estudo funcional das variantes c.472C>T (p.Arg158Trp); c.958G>A (p.Gly320Arg) e c.986T>C (p.Leu329Pro) evidenciaram uma atividade reduzida em todas as proteínas mutantes. Análises de docking indicaram que um aumento na afinidade por inibidores da FBPase pode ser o mecanismo envolvido na patogenicidade das variantes p.Gly320Arg e p.Leu329Pro. Conclusões: Nossos resultados mostram que pacientes brasileiros com IHF apresentam um perfil genético homogêneo, o que permite a análise direcionada para a detecção de alelos frequentes como abordagem para o diagnóstico molecular desses pacientes. Já a DFB apresenta uma maior heterogeneidade alélica entre pacientes brasileiros, o mesmo que é observado em outras populações. O panorama observado através das análises evidenciou a necessidade de ampliação nos estudos a respeito dos erros inatos do metabolismo da frutose na população brasileira e em outras populações. Especialmente porque, com a epidemia crescente de doenças associadas ao consumo exacerbado desse monossacarídeo, os erros inatos do metabolismo envolvidos nessa rota podem servir de modelos ao estudo de outras doenças, como a DHGNA, por exemplo.Introduction: Fructose is a monosaccharide available in free form or integrated to the sucrose molecule, being produced endogenously from sorbitol by sorbitol dehydrogenase. The metabolism of this sugar is carried out by three enzymes: 1) the fructokinase catalyzes the first reaction in the route, the phosphorylation to fructose-1P; 2) aldolase B (in the liver, intestine and kidneys) converts this molecule into two trioses (dihydroxyacetone-P and glyceraldehyde); 3) fructose-1,6-biphosphatase hydrolyzes the fructose-1,6-bisphosphate into fructose-6P. Three inborn errors are described, all of which are autosomal recessive inheritance, involving the fructose metabolism: essential fructuria (EF), hereditary fructose intolerance (HFI) and fructose-1,6-biphosphatase deficiency (FBD). EF is asymptomatic. HFI is caused by pathogenic variants in the ALDOB gene that result in deficient aldolase B. FBD is a consequence of pathogenic alterations in the FBP1 gene. Currently, the main diagnosis method for HFI and FBD is the analysis of the ALDOB and FBP1 genes, respectively. Both diseases are treated by a diet restricted in fructose, and the FBD indicates the consumption of raw corn starch, to help maintain normoglycemia. Main objective: to characterize the genetic profile of Brazilian patients with HFI and FBD. Specific objectives: I. To relate the recent discoveries involving fructose metabolism and their influence in the development of new therapeutic approaches for IHF and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD); II. To analyze the worldwide distribution of the most frequent pathogenic variants in ALDOB; III. To analyze the frequency of pathogenic and /or predicted variants as such in the ALDOB gene in gnomAD and estimate the prevalence of HFI from the frequency of heterozygotes for these variants; IV. To analyze the genetic profile of Brazilian patients with HFI by relating the pathogenic variants detected to the geographic region of the country; V. To develop V. To develop an algorithm for the genetic diagnosis of Brazilian patients with HFI; VI. To identify the variants evolved with the pathogenesis of FBD in Brazilian patients; VII. To characterize by in silico approaches variants detected in the FBP1 gene; VIII. To perform in vitro functional analysis of new FBP1 variants detected in Brazilian patients. Methodology: The study was carried out in stages. Stage 1: a narrative and systematic review about the molecular aspects of HFI was carried out. Stage 2: the genetic profile of Brazilian patients with clinical suspicion or diagnosis of HFI (n = 23) was determined by massive parallel sequencing. From this, an algorithm for the genetic diagnosis of Brazilian patients with HFI was developed. Stage 3: genetic analysis of Brazilian patients with FBD (n = 7) by massive parallel sequencing and automated Sanger sequencing. Pathogenic variants detected in FBP1 were characterized by in silico analysis. Stage 4: functional analysis of the c.472C> T, c.958G> A and c.986T> C variants detected in FBP1. Results: Stage 1: the literature review showed that the variants p.Ala150Pro, p.Ala175Asp and p.Asn120Lysfs * 32 account for ~ 70% of the pathogenic alleles identified in patients of different ethnicities. These variants have specific patterns of distribution which give evidence of their probable origins. In addition, HFI prevalence analysis was performed based on the frequency of heterozygous with pathogenic variants described in gnomAD. The results show that the estimated prevalence of HFI varies between populations, with the highest prevalence observed in non-Finnish Europeans (1 / 26,817). Stage 2: the analysis of Brazilian patients showed four variants involved in the pathogenesis of HFI: c.178C> T (p.Arg60Ter), c.360_363delCAAA (p.Asn120Lysfs), c.448G> C (p.Ala150Pro) and c. 524C> A (p.Ala175Asp). It is observed that the pattern of distribution of these alleles varies according to the geographic region of the countr It is observed that the pattern of distribution of these alleles varies according to the geographic region of the country. Thus, the most frequent variant in patients 15 in the South is p.Ala150Pro while in Minas Gerais it is p.Arg60Ter. From the analyzes performed, an algorithm for the molecular diagnosis of HFI in Brazilian patients was developed, so that the analysis directed to detecting the most frequent alleles in this population results in a diagnostic rate of ~ 100%. Stage 3: FBP1 gene analyses detected three pathogenic variants in patients from Rio Grande do Sul (n = 6): c.472C>T (p.Arg158Trp); c.958G>A (p.Gly320Arg) and c.986T>C (p.Leu329Pro). The last two alleles are not yet described in the literature. In silico analyses did not show structural changes in the protein that would indicate the pathogenicity of these alleles. In addition, the analysis of a patient from Alagoas, daughter of consanguineous parents, evidenced the presence of the variant c.611_614delAAAA (p.Lys204Argfs*72) in homozygosis. Computational analyses showed that the loss of substrate binding sites and post-translational modifications, in addition to increase in the disorder in the protein structure, are indications of the pathogenicity of this allele. Stage 4: the functional study of the c.472C>T (p.Arg158Trp); c.958G>A (p.Gly320Arg) and c.986T>C (p.Leu329Pro) variants evidenced a reduced activity in all mutant proteins. Docking analyses indicated that an increase in affinity for FBPase inhibitors may be the mechanism involved in the pathogenicity of the p.Gly320Arg and p.Leu329Pro variants. Conclusions: Our results show that Brazilian patients with HFI have a homogeneous genetic profile, which allows analysis directed towards the detection of frequent alleles in the molecular diagnosis of Brazilian patients. FBD, on the other hand, presents a greater allelic heterogeneity among Brazilian patients, the same thing that is observed in other populations. The panorama drawn by the analyses evidenced the need for expansion in studies regarding the inborn errors of fructose metabolism in the Brazilian population and other populations. Especially because, with the growing epidemic of diseases associated with the exacerbated consumption of this monosaccharide, the inborn errors of metabolism involved in this route can serve as models for the study of other diseases, such as NAFLD, for example