From egg to embryo: Analysis of genes expressed in early embryonic stages of Apis mellifera

O início do desenvolvimento embrionário é único e possui características próprias, onde cada componente é programado para atuar em um local e hora precisamente definidos. Em sua fase inicial, o embrião não apresenta transcrição zigótica, sendo mantido por componentes moleculares depositados pela mãe durante a oogênese. A ativação transcricional do genoma zigótico é coordenada com a degradação dos mRNAs de origem materna, resultando em uma mudança no perfil transcricional do embrião. Assim, durante essa transição, denominada materno-zigótica (MZT), o zigoto estabelece o controle de seu desenvolvimento. A degradação dos produtos maternos ocorre principalmente pela ação conjunta de Smaug e Zelda. Em Drosophila melanogaster, a transcrição zigótica aumenta gradualmente do ciclo 2 ao ciclo 13 do desenvolvimento embrionário. Zelda é um gene com papel essencial no início da embriogênese. A homologia, a sequência deste gene e os domínios funcionais são altamente conservados na ordem Hymenoptera, bem como em outras espécies investigadas. Experimntos piloto detectaram a expressão zelda logo nos primeiros ciclos do desenvolvimento embrionário de Apis mellifera, o que motivou a investigação de outros genes igualmente importantes nos passos iniciais do desenvolvimento embrionário. A partir de bibliotecas RNAseq selecionamos RpL32, troponina C tipo IIb, takeout, engrailed even-skipped, hairy, kruppel e odd-skipped para análise de expressão apartir de ovócito (tempo zero, 0), 2 e 6 horas de desenvolvimento. Para isto foram desenhados primers para as duas formas de transcritos, pré-splicing e pós-splicing, como forma de validar a transcrição pelo embrião. Os resultados apontam para uma atividade de síntese de novos transcritos na primeira hora de desenvolvimento embrionário. Para complementar os achados e verificar os ciclos mitóticos daquele período, os núcleos de embriões diplóides com 1 hora de desenvolvimento após a postura foram marcados com DAPI, a fim de verificar os ciclos mitóticos desse período. Observamos, com 1 hora de desenvolvimento, três núcleos de clivagem, indicando que eles passaram por dois ciclos mitóticos, sugerindo uma divisão assíncrona. Esses achados indicam fortemente que pode haver expressão do gene zigótico nos primeiros ciclos mitóticos do embrião de A. mellifera. Por fim, foi feita a reconstrução de redes de interação gene - proteínas em fases iniciais do desenvolvimento embrionário. Os resultados apontam que vários genes e proteínas podem estar envolvidos nas fases iniciais da ativação do zigoto. Acreditamos que esses resultados certamente ajudarão a esclarecer os primeiros passos da embriogênese nesse organismo modelo, abrindo novos e promissores campos para estudos nessa área.The onset of embryonic development is unique and has its own characteristics, where each component is programmed to act in a precisely defined place and time. In its initial phase, the embryo has no zygotic transcription, being maintained by molecular components deposited by the mother during oogenesis. The transcriptional activation of the zygotic genome is coordinated with the degradation of maternally derived mRNAs, resulting in a change in the embryo transcriptional profile. Thus, during this transition, called materno-zygote (MZT), the zygote establishes control of its development. The degradation of maternal products occurs mainly by the joint action of Smaug and Zelda. In Drosophila melanogaster, zygotic transcription gradually increases from cycle 2 to cycle 13 of embryonic development. Zelda is a gene that plays an essential role in early embryogenesis. The homology, sequence of this gene and functional domains are highly conserved in the order Hymenoptera, as well as in other investigated species. Pilot experiments detected zelda expression early in the early stages of Apis mellifera embryonic development, which prompted the investigation of other equally important genes in the early stages of embryonic development. From RNAseq libraries we selected RpL32, tropoinin C type IIb, takeout, engrailed even-skipped, hairy, kruppel and oddskipped for expression analysis from oocyte (time zero, 0), 2 and 6 hours of development. For this purpose, primers were designed for both transcript forms, presplicing and post-splicing, as a way to validate transcription by the embryo. The results point to a synthesis activity of new transcripts in the first hour of embryonic development. To complement the findings and verify the mitotic cycles of that period, the nuclei of diploid embryos with 1 hour of development after laying were marked with DAPI in order to verify the mitotic cycles of this period. We observed at 1 hour of development, three cleavage nuclei, indicating that they went through two mitotic cycles, suggesting an asynchronous division. These findings strongly indicate that there may be zygotic gene expression in the early mitotic cycles of the A. mellifera embryo. Finally, the reconstruction of gene - protein interaction networks in early embryonic development was performed. The results indicate that several genes and proteins may be involved in the early stages of zygote activation. We believe that these results will certainly help to clarify the first steps of embryogenesis in this model organism, opening new and promising fields for studies in this area