Proteomic analysis of primary tooth enamel for sex estimation in children

Os métodos de estimativa de sexo em contextos forenses são realizados em esqueletos adultos por meio de análises métricas, morfológicas ou por DNA especificamente pelo gene da amelogenina relacionado ao cromossomo sexual. Porém, a aplicação de metodologias semelhantes em amostras forenses de esqueletos subadultos enfrentam limitações que levam ao insucesso da estimativa correta do sexo. A proteína amelogenina é expressa no elemento dental, que devido à sua dureza, durabilidade e resistência a insultos post mortem, sobrevive a uma variedade de efeitos destrutivos causados por alterações mecânicas, químicas, físicas e térmicas, se tornando um repositório de informações. As amelogeninas, por splicing alternativo, derivam isoformas que diferenciam suas origens dos cromossomos X ou Y. Por atuação de enzimas MMP-20 e KLK4 durante a amelogênese, peptídeos são gerados permanecendo no interior dos prismas do esmalte. Sendo assim, o presente trabalho objetivou extrair, identificar e analisar qualitativamente e quantitativamente, por cromatografia líquida e espectrometria de massas, esses peptídeos derivados das isoformas Y e X do gene da amelogenina, AMELY e AMELX respectivamente, presentes no esmalte de dentes decíduos de crianças entre 6 e 8 anos de idade para estimar o sexo no processo de identificação humana em esqueletos subadultos. Foram extraídos peptídeos da AMELY e AMELX do esmalte dental de 40 dentes decíduos pela técnica de ataque ácido com HCl a 10% na coroa dental utilizando uma ponteira Zip Tipâ C18 e posterior injeção para análise no sistema EASY-nLC IIÔ acoplado a um espectrômetro de massas LTQ Orbitrap Velos para sequenciar e diferenciar os peptídeos AMELY e AMELX para a estimativa do sexo biológico das crianças. Os raw data gerados pelo espectrômetro de massas foram confrontados no software Proteome Discoverer 2.3 juntamente com o SEQUEST contra o banco de dados UniProt. Foram selecionados para estudos os 4 peptídeos da AMELY e 9 peptídeos da AMELX mais prevalentes identificados nas amostras. Os resultados mostraram que foi possível diferenciar e identificar peptídeos AMELY e AMELX utilizando o software Tracefinder(TM), e analisar qualitativamente as amostras. Os resultados mostraram que 15 amostras do grupo feminino e 19 amostras do grupo masculino tiveram concordância entre os sexos real e estimado das crianças. Quantitativamente foi demonstrado a prevalência de expressão e equilíbrio de distribuição da AMELX nas amostras do grupo masculino em relação ao grupo feminino. E pode-se concluir que a análise por nLC-MS/MS dos peptídeos dimórficos da amelogenina presentes em dentes decíduos pode ser utilizada de forma segura para a estimativa do sexo biológico em esqueletos de crianças entre 6 e 8 anos de idade na prática forense, sobressaindo de forma confiável e vantajosa às metodologias aplicadas nos dias atuais por análises métricas e morfológicas.Sex estimation methods in forensic contexts are performed on adult skeletons by metric, morphological or DNA analysis specifically by the sex chromosome-related amelogenin gene. However, the application of similar methodologies to forensic samples of subadult skeletons face limitations that lead to the failure to correctly estimate sex. Amelogenin protein is expressed in the dental element, which due to its hardness, durability and resistance to post mortem insults, survives a variety of destructive effects caused by mechanical, chemical, physical and thermal changes, becoming a repository of information. Amelogenins, by alternative splicing, derive isoforms that differentiate their origins from X or Y chromosomes. By acting MMP-20 and KLK4 enzymes during amelogenesis, peptides are generated remaining within the enamel prisms. Thus, the present work aimed to extract, identify and analyze qualitatively and quantitatively, by liquid chromatography and mass spectrometry, these peptides derived from the amelogenin gene Y and X, AMELY and AMELX respectively, present in the primary teeth enamel of children between 6 and 8 years old to estimate sex in the human identification process in subadult skeletons. AMELY and AMELX peptides were extracted from 40 primary teeth enamel by 10% HCl acid etching technique using a Zip Tip C18â tip and subsequent injection for analysis on the EASY-nLC IIÔ system coupled to a mass spectrometer LTQ Orbitrap Velos to sequence and differentiate the AMELY and AMELX peptides to estimate the biological sex of children. The raw data generated by the mass spectrometer were compared in Proteome Discoverer 2.3 software together with SEQUEST against the UniProt database. The 4 AMELY peptides and 9 most prevalent AMELX peptides identified in the samples were selected for studies. The results showed that it was possible to differentiate and identify AMELY and AMELX peptides using Tracefinder (TM) software, and to qualitatively analyze the samples. The results showed that 15 samples from the female group and 19 samples from the male group had agreement between the real and estimated sexes of the children. Quantitatively, the prevalence of AMELX expression and distribution equilibrium in the samples of the male group in relation to the female group was demonstrated. It can be concluded that nLC-MS / MS analysis of amelogenin dimorphic peptides present in primary teeth can be safely used to estimate biological sex in skeletons of children aged 6 to 8 years in forensic practice, reliably and advantageously stand out to the methodologies applied today by metric and morphological analysis