The immediate response to juvenile hormone in the fat body of honey bee larvae

A diferenciação das castas na abelha melífera Apis mellifera é regulado pela interação do hormônio juvenil (HJ) com as vias de sensoriamento de nutrientes (IIS, TOR e EGFR) e, através da sinalização de hipóxia, associada a uma dinâmica mitocondrial castaespecífica no corpo gorduroso, que é o centro metabólico dos insetos. Larvas de rainhas apresentam maiores títulos de HJ e maior taxa respiratória que larvas de operárias. No entanto, não sabemos como esses fatores são funcionalmente conectados. Nesse projeto investigamos a resposta transcricional e fisiológica imediata do HJ em larvas operária, especificamente no corpo gorduroso. A hipótese foi que a aplicação tópica deste hormônio em larvas operárias possa mimetizar as condições endógenas observadas em rainhas. No primeiro experimento, larvas de operárias do quarto (L4) e quinto instar inicial (L5F2) foram coletadas de favos e transferidos para um sistema de criação in vitro. No experimento, 3 grupos experimentais foram definidos. No primeiro grupo, larvas receberam uma aplicação tópica de 10 µg de HJ-III sintético em 2 µL de acetona. O segundo grupo recebeu quantidade igual de solvente e o terceiro grupo foi mantido como não tratado. Após 1, 6 e 24 horas, o corpo gorduroso dessas larvas foi dissecado para extração de RNA e síntese de cDNA para quantificação dos níveis de transcritos por RT-qPCR dos seguintes genes: Kr-h1, o gene de resposta imediata à HJ como controle da eficiência do tratamento, genes candidatos de dinâmica mitocondrial (ERR, TOR, TFB2, FOXO, OPA1 e FIS1) e hipóxia (Sima, Fatiga). Para averiguar a influência do hormônio na eficiência mitocondrial, foi realizado experimento de respirometria de alta resolução, e avaliamos também a morfologia das mitocôndrias do corpo gorduroso por meio de microscopia eletrônica de transmissão. No segundo experimento os perfis de expressão gênica no corpo gorduroso de larvas L5F2 tratados ou não com HJ foi avaliada por RNA-seq seguido de análises de bioinformática para identificação de genes diferencialmente expressos. Referente ao experimento 1, apenas os genes Estrogenrelated receptor (ERR) e OPA1 apresentaram uma resposta imediata significativa ao tratamento com HJ. Nas análises morfofisiológicos das mitocôndrias, as análises de respirometria de alta resolução não evidenciaram diferença no consumo de oxigênio como resposta direta ao HJ. No entanto, observou-se uma resposta ao HJ na morfologia das mitocôndrias, que sofriam modificações estruturais imediatas, mas logo retornavam ao normal, com o possível efeito de proteção mitocondrial da proteína OPA1. No segundo experimento, os resultados de RNA-seq mostraram diversos genes com resposta imediata ao HJ, entre estes, genes relacionados com a via de biossíntese do próprio hormônio, como também genes relacionadas à sinalização por ecdisona, metabolismo energético e diversas vias de sinalização de resposta a nutrientes. Também observamos uma ampla quantidade de transcritos diferencialmente expressos, para quais não há informações funcionais disponíveis. Concluímos, portanto, que, ao contrário da nossa hipótese, o HJ não age diretamente a nível fisiológico nas mitocôndrias, mas influencia consideravelmente o perfil transcricional do corpo gorduroso das larvas, dando pistas interessantes para futuras investigações.Caste differentiation in the honey bee Apis mellifera is regulated by the interaction of juvenile hormone (JH) with various signaling pathways involved in nutrient sensing (IIS, TOR and EGFR), as well as with the hypoxia response, associated with caste-specific mitochondrial changes in the fat body, which is the metabolic center of insects. Nonetheless, not much is known on how these factors are functionally connected. In this project we investigated the immediate transcriptional and physiological responses to JH in the fat body of worker larvae. The hypothesis was that a topical application of this hormone on worker larvae would mimic the endogenous conditions seen in queen larvae. In the first experiment, fourth (L4) and early fifth-instar (L5F2) worker larvae were taken from brood frames and transferred to an in vitro rearing system. The experiment consisted of 3 experimental groups. Those of the first group received a topical application of 10 µg of synthetic JH-III dissolved in 2 µL of acetone. The second group received an application of the same volume of the solvent, and the third group remained untreated. After 1, 6 and 24 hours the larval fat body was dissected for RNA extraction, cDNA synthesis, and RT-qPCR quantification of the transcript levels of the following genes: Kr-h1, the immediate response gene to JH as a control of the treatment efficiency, and candidate genes related to mitochondrial dynamics (ERR, TOR, TFB2, FOXO, OPA1 and FIS1) and the hypoxia response (Sima, Fatiga). The analysis of mitochondrial efficiency was done by means of high resolution respirometry, and mitochondrial morphology was observed by electron transmission microscopy. In the second experiment we investigated the gene expression profiles in the fat body of L5F2 larvae, treated or not with JH by means of RNA-seq followed by a bioinformatics identification of the differentially expressed genes. With respect to experiment 1, we found that only the genes Estrogen-related receptor (ERR) and OPA1 showed an immediate transcriptional response to JH. In the morphophysiological analysis of the mitochondria we found no difference for oxygen consumption between the groups. However, we observed a rapid yet transient response to the JH treatment in mitochondrial morphology. After this change, the mitochondria soon returned to their normal morphology, and we think that the OPA1 protein may play a role in this mitochondrial stress response. In the second experiment, the RNA-seq results revealed various genes with a direct response to JH. Among these were genes involved in the biosynthesis of the hormone itself, as well as genes related to ecdysone signaling, energy metabolism, and different nutrient sensing pathways. We also noted a considerable proportion of differentially expressed genes for which no functional information is available. In conclusion, the results show that, JH does not act directly on the physiology of the mitochondria, contrary to our hypothesis, but that it considerably affects the transcriptional profile of the larval fat body, providing interesting clues for future investigations