Synthesis and Characterization of Polymers containing 2-(dimethylamino) ethyl methacrylate and its Biological and Biomimetic Applications

Polímeros são constituídos por unidades repetitivas (meros). Quando consistem em apenas um tipo de mero são denominados homopolímeros e, possuindo mais de um tipo, copolímeros. A natureza destas unidades e a maneira como se ligam nas cadeias poliméricas definem as propriedades dos polímeros, que podem incluir mudanças com pH e temperatura. O uso de diferentes monômeros permite desenvolver polímeros para aplicações como entrega de genes ou formação de vesículas poliméricas (polimerossomos), objetivos desta tese. Visando desenvolver materiais poliméricos para essas aplicações, vários polímeros e copolímeros foram sintetizados, usando a técnica RAFT: (sigla inglesa para Reversible AdditionFragmentation Chain Transfer), uma das variantes da técnica de Polimerização por Desativação Reversível de Radicais (PDRR). Proporções variáveis de metacrilato de 2-(dimetilamino) etila (DMAEMA), metacrilato de metila (MMA) e estireno (S) permitiram sintetizar vários materiais. Os polímeros obtidos neste trabalho foram caracterizados por Cromatografia de Permeação em Gel (GPC, como sigla em inglês), Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (comumente chamada pela sigla inglesa: FTIR) e Ressonância Magnética Nuclear de prótons (RMN de 1H). Resultados obtidos por Espalhamento Dinâmico de Luz (em inglês, DLS: Dynamic Light Scattering) das amostras de PDMAEMA315-b-PS244 e PDMAEMA315-b-PS781 em tampão TRIS-HCl, (pHs 7,4 e 8,0) demonstraram que o número de partículas diminuiu com o aumento de pH. O número de partículas é maior quando formadas em tampão fosfato pH 8 devido a uma maior compactação do polímero. As amostras preparadas em tampões Tris-HCl e fosfato, (pH 8), mostraram menores valores de Potencial Zeta quando em tampão fosfato. O tamanho das partículas foi compatível com vesículas em todas as condições estudadas e esses polimerossomos tiveram aumento no seu diâmetro hidrodinâmico (Dh), a partir de 65 °C (PDMAEMA315-b-PS244) e 85 °C (PDMAEMA315-b-PS781), quando em tampão fosfato. Análise dos polimerossomos por Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) e Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) por Coloração Negativa mostraram, respectivamente, a existência de um compartimento interno capaz de incorporar uma sonda hidrofílica e revelaram vesículas com aproximadamente 80 nm de diâmetro. Paralelamente, foram realizados experimentos de eletroforese em gel de agarose com um DNA plasmideal (pUC19), na presença de polímeros de PDMAEMA315 (RAFT), PMMA3-co-PDMAEMA26 e PMMA31-co-PDMAEMA70 (RAFT). Observou-se migração alterada de pUC19 no gel de agarose e até mesmo retenção de DNA próximo ao slot de aplicação. O PMMA60 não afetou a migração do pUC19, mostrando a importância do PDMAEMA para a interação com DNA. Polímeros contendo DMAEMA também mediaram a entrega de pUC19 em células de E. coli não competentes. Apenas as células de E. coli incubadas com PMMA3-co-PDMAEMA26 ou PMMA31-co-PDMAEMA70 (RAFT), mas não com PDMAEMA315 ou PMMA60 (ambos obtidos via RAFT), foram eficientemente transformadas, sugerindo que uma pequena fração de PMMA nas cadeias depolímeros é necessária para transfecção. Esses resultados abrem caminho para o desenvolvimento de novos agentes de entrega de DNA, candidatos a uma variedade de aplicações.Polymers consist of repeating units or groups (monomers). Homopolymers consist of only one type of group and copolymers contain more than one type of monomer. The nature of the monomers and the binding type in the polymer chains define the properties of the polymers, which may include changes with pH and temperature. The use of different monomers allows the development of polymers for applications such as gene delivery or the formation of polymeric vesicles (polymersomes), the objectives of this thesis. In order to develop polymeric materials for these applications, several polymers and copolymers were synthesized using RAFT (Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer), one of the variants of the Radical Reversible Deactivation Polymerization (RRDP) technique. Variable proportions of 2- (dimethylamine) ethyl methacrylate (DMAEMA), methyl methacrylate (MMA) and styrene (S) allowed the synthesis of several materials. The polymers obtained here were characterized by Gel Permeation Chromatography (GPC), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and Proton Nuclear Magnetic Resonance (1H NMR). Results obtained by Dynamic Light Scattering (DLS) of the PDMAEMA315-b-PS244 and PDMAEMA315-b-PS781 in TRIS-HCl buffer (pHs 7.4 and 8.0) demonstrated that the number of particles decreased with increasing pH. The number of particles was higher when formed in phosphate buffer pH 8 due to increased compaction of the polymer. Samples prepared in Tris-HCl and phosphate buffers, (pH 8), showed lower Zeta Potential values. The size of the particles was compatible with vesicles under all conditions studied and these polymers increased the hydrodynamic diameter (Dh), from 65 °C (PDMAEMA315-b-PS244) and 85 °C (PDMAEMA315-b-PS781), when in phosphate buffer. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) and Negative Staining Transmission Electron Microscopy showed the existence of an internal vesicle compartments capable of incorporating a hydrophilic probe and revealed vesicles with approximately 80 nm diameter. In parallel, agarose gel electrophoresis experiments with a plasmid DNA (pUC19) were performed in the presence of PDMAEMA315, PMMA3-co-PDMAEMA26 and PMMA31- co-PDMAEMA70 (RAFT) polymers. There was altered migration of pUC19 on the agarose gel and even retention of DNA near the application slot. PMMA60 did not affect the migration of pUC19, showing the importance of PDMAEMA for interaction with DNA. DMAEMA-containing polymers also mediated the delivery of pUC19 in non-competent E. coli cells. Only E. coli cells incubated with PMMA3-co-PDMAEMA26 or PMMA31-co-PDMAEMA70 (RAFT), but not with PDMAEMA315 (RAFT) or PMMA60 (RAFT), were efficiently transformed, suggesting that a small fraction of PMMA in the polymer chains is required for transfection. These results pave the way for the development of new DNA delivery agents, candidates for a variety of applications