Study of Cwc24 phosphorylation as a splicing factor in Saccharomyces cerevisiae

Splicing é o nome dado à reação de remoção de íntrons em pré-RNAs e ligação de éxons para formar mRNAs maduros. É catalisado pelo spliceossomo, um complexo altamente dinâmico formado por snRNPs, associações entre snRNAs e proteínas, facilitando o processo de excisão das sequências não codificadoras por meio de duas reações de transesterificação. O spliceossomo é montado de novo em cada pré-RNA que será processado. Para isso, a montagem é sequencial e coordenada em grande parte pelas interações proteicas, as quais são cuidadosamente reguladas, muitas vezes por modificações pós-traducionais, como fosforilação, ubiquitinação, sumoilação, entre outras, que podem influenciar as funções das proteínas, e consequentemente, etapas durante o splicing. Uma proteína essencial em Saccharomyces cerevisiae que possui um papel fundamental no splicing é Cwc24, responsável por proteger o 5´SS (splice site) de um ataque nucleofílico prematuro durante a primeira reação de transesterificação, e que auxilia na estabilização da ligação do complexo U2 snRNP ao pré-RNA. Cwc24 interage com diversas proteínas da maquinaria de splicing. Através de ensaios de high throughput de proteômica, foram identificados sítios de fosforilação em Cwc24. Partindo desta informação, o objetivo deste trabalho foi o de caracterizar o papel da fosforilação de Cwc24 no controle de sua função durante o splicing em Saccharomyces cerevisiae. Os resultados obtidos confirmaram que Cwc24 é fosforilada nos seus dois resíduos de serinas identificados por análise proteômica. Entretanto, mutações nesses dois resíduos de serina não afetaram a viabilidade celular em condições normais e em condições de estresse de crescimento. Testes de estabilidade proteica mostraram que as substituições dos aminoácidos também não possuíam um efeito na estabilidade desta proteína. As mutações também não alteraram o processamento de pré-RNA. A fosforilação de Cwc24 está presente no contexto da interação com outros fatores de splicing, porém não é crucial para a interação, uma vez que o mutante fosfodeficiente é capaz de interagir com as mesmas proteínas da mesma forma que a proteína selvagem. Assim, os resultados obtidos nos permitiram concluir que a fosforilação da Cwc24 pode estar envolvida em algum outro processo celular que possa estar interligado ao splicing de pré-RNA, ou que seu efeito na função de Cwc24 seja muito sutil para ser percebido através da metodologia utilizada.Splicing is the name given to the intron removal reaction in pre-RNAs and binding of exons to form mature mRNAs. It is catalyzed by the spliceosome, a highly dynamic complex formed by snRNPs, snRNAs and protein associations, facilitating the process of excision of noncoding sequences by two transesterification reactions. The spliceosome is assembled on each pré-RNA that will be processed. For this, the assembly is sequential and largely coordinated by protein interactions, which are carefully regulated, often by post-translational modifications, such as phosphorylation, ubiquitination, sumoylation, among others, which may influence the functions of proteins, and consequently, steps during splicing. An essential protein in Saccharomyces cerevisiae that plays a key role in splicing is Cwc24, which protects the 5´SS (splice site) from a premature nucleophilic attack during the first transesterification reaction, and which assists in stabilizing the binding of the U2 snRNP complex to pre-RNA. Cwc24 interacts with several proteins of the splicing machinery. Phosphorylation sites in Cwc24 sequence were identified in a high throughput proteomics assay. The objective of this work was to characterize the role of the Cwc24 phosphorylation in the control of its function during splicing in Saccharomyces cerevisiae. The results showed that Cwc24 is phosphorylated in its two serine residues identified by large scale proteomics assays. By creating mutants in these two serine residues, several aspects of the protein were studied. We have seen that mutations did not affect cell viability under normal conditions and under stress growth conditions. Protein stability was tested and we saw that amino acid substitutions also had no effect on the protein. Looking at their function in the context of splicing, we saw that the mutants did not change pre-RNA processing. Cwc24 phosphorylation is present in the context of interaction with other splicing factors, but is not crucial for interaction since the phosphodeficient mutant is capable of interacting with the same proteins as wild protein. Thus, we were able to conclude that Cwc24 phosphorylation could be involved in some other cellular process that may be linked to pre-RNA splicing, or that the methodology used was not sensitive enough to detect of the mutations on Cwc24 function