Caracterização molecular de Staphylococcus aureus e Streptococcus uberis isolados de infecções intramamárias de vacas leiteiras

The bovine mastitis is the disease more frequent of dairy cows, which results in significant economic losses. Staphyloccoccus aureus and Streptococcus uberis are among the main causes of clinical (CM) and subclinical (MSC) mastitis, because they are difficult to control by conventional measures, since both have mechanisms of immune system evasion, adherence and internalization in the mammary tissues. Therefore, this thesis was organized in three experiments: 1) Genotypic characterization of S. aureus isolated from mastitis from Brazilian herds and from other countries; 2) Genotypic characterization and antimicrobial sensitivity of S. aureus isolates identified before and after treatment of MSC during lactation; and 3) Genotypic diversity and virulence factors of S. uberis isolated from intramammary infections of dairy cows in Brazil. In experiment 1, 70 S. aureus isolates (35 from MC and 35 from MSC) were identified in milk samples from cows\' mammary quarters in 16 herds in Brazil. After the selection, 15 Brazilian isolates were grouped with isolates from Argentina (n=16), Colombia (n=15), Germany (n=17), Italy (n=17), USA (n=17), South Africa (n=11) and Tunisia (n=12) for genotyping by RS-PCR, based on the amplification of the 16S-23S rRNA intergenic space and investigated in relation to 26 virulence factors. In experiment 2, 79 S. aureus isolates were genotyped by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and evaluated by minimum inhibitory concentration (MIC) to assess antimicrobial resitance profiles. In experiment 3, 44 isolates of S. uberis were evaluated by DNA hybridization using the dot blot methodology, to determine the genotypic diversity. The results of experiment 1 indicated high genotypic variability of S. aureus according to the countries evaluated, and high prevalence of genes related to invasion to the host organism (clfA, cna, fmtB and leucocidins). In addition, it was shown that the genotype pattern os S. aureus isolates were specific to each country, suggesting that control strategies should be formulated according to the region in question and the virulence of the strains involved in the infection. In experiment 2, a high similarity was identified between the isolates of the same herd, indicating genotypic specificity within the same region, even after treatments during lactation. In addition, all the isolates evaluated were susceptible to gentamicin, enrofloxacin, ciprofloxacin and tetracycline, although high resistance to amoxicillin and cephalexin has also been observed. In experiment 3, nine dot blot patterns were observed, indicating high heterogeneity of S. uberis isolates. It was possible to observe a high prevalence of genes regulating virulence factors, such as sua and gapC, responsible for the adherence and internalization of S. uberis in the mammary gland tissues. Thus, after the conclusion of the three studies, it was possible to conclude that there is a high genotypic diversity in S. aureus and S. uberis isolated from bovine intramammary infections in Brazil. In addition, it has been confirmed that these two species have numerous virulence factors that contribute to their permanence in the mammary gland and a limit control based on conventional measures. However, these control measures, such as the use of post-dipping, registration and monitoring of clinical cases and the culling chronic cows must be part of the bovine mastitis prevention plan, in order to reduce the severity and dispersion of cases. Molecular techniques are efficient in the identification and genetic characterization of bacterial isolates and can be auxiliary tools in the diagnosis and epidemiology of mastitis, guiding the control and treatment strategies of the disease.A mastite bovina é a doença mais frequente em vacas leiteiras, o que resulta em significativas perdas econômicas. Staphyloccoccus aureus e Streptococcus uberis estão entre as principais causas de mastite clínica (MC) e subclínica (MSC), pois são de difícil controle por medidas convencionais, já que ambos possuem mecanismos de evasão do sistema imune, aderência e internalização nos tecidos mamários. Sendo assim, esta tese foi organizada em três experimentos: 1) Caracterização genotípica de S. aureus isolados de mastite de rebanhos brasileiros e de outros países; 2) Caracterização genotípica e sensibilidade aos antimicrobianos de isolados de S. aureus identificados antes e após o tratamento de MSC durante a lactação e 3) Diversidade genotípica e fatores de virulência de S. uberis isolados de infecções intramamárias de vacas leiteiras no Brasil. No experimento 1, 70 isolados de S. aureus (35 de MC e 35 de MSC) foram isoladas de amostras de leite de quartos mamários de vacas em 16 rebanhos do Brasil. Após a seleção, 15 isolados brasileiros foram agrupados à isolados provenientes da Argentina (n=16), Colômbia (n=15), Alemanha (n=17), Itália (n=17), EUA (n=17), África do Sul (n=11) e Tunísia (n=12) para genotipagem por RS-PCR, baseada na amplificação do espaço intergênico 16S-23S rRNA e investigados em relação a 26 fatores de virulência. No experimento 2, 79 isolados de S. aureus foram genotipados por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) e avaliados quanto à concentração inibitória mínima (CIM) para determinação dos perfis de resistência aos antimicrobianos. No experimento 3, 44 isolados de S. uberis foram avaliados por hibridização de DNA através da metodologia dot blot para determinação da diversidade genotípica. Os resultados do experimento 1 indicaram alta variabilidade genotípica de S. aureus dentre os países avaliados e maior prevalência de genes relacionados à invasão ao organismo do hospedeiro (clfA, cna, fmtB e leucocidinas). Além disso, foi demonstrado que o padrão genotípico de isolados de S. aureus foi específico para cada país, sugerindo que as estratégias de controle devem ser formuladas de acordo com a região em questão e com a virulência das cepas envolvidas na infecção. No experimento 2, foi identificada alta similaridade entre os isolados de um mesmo rebanho indicando especificidade genotípica dentro de uma mesma região, mesmo após os tratamentos durante a lactação. Além disso, todos os isolados avaliados se mostraram suscetíveis à gentamicina, enrofloxacina, ciprofloxacina e tetraciclina, embora alta resistência frente à amoxicilina e cefalexina tenham sido também observadas. No experimento 3, foram observados nove padrões de dot blot, indicando alta heterogeneidade dos isolados de S. uberis. Foi possível observar alta prevalência dos genes reguladores de fatores de virulência, como sua e gapC, responsáveis pela aderência e internalização de S. uberis nos tecidos da glândula mamária. Assim, após a conclusão dos três estudos, foi possível concluir que há alta diversidade genotípica em S. aureus e S. uberis isolados de infecções intramamárias no Brasil. Além disso, foi confirmado que estas duas espécies apresentam inúmeros fatores de virulência que contribuem para permanência na glândula mamária e dificultam o controle da mastite por meio de medidas convencionais. No entanto, estas medidas de controle, tais como utilização de pós-dipping, registro e monitoramento dos casos clínicos e descarte dos animais crônicos devem fazer parte do plano de prevenção da mastite bovina, afim de diminuir a gravidade e a dispersão dos casos. As técnicas moleculares são eficientes na identificação e caracterização genética de isolados bacterianos e podem ser ferramentas auxiliares no diagnóstico e epidemiologia da mastite, direcionando as estratégias de controle e tratamento da doença