Characterization of flower induction and fertilization of Quercus suber

Tese de doutoramento em Ciências (Especialidade em Biologia)A notoriedade de Quercus suber em Portugal é reforçada, não só pela sua importância económica devido à cortiça, mas também pelas bolotas usadas para alimentação animal. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares envolvidos na indução e libertação de dormência que intervêm no crescimento anual da planta, ou sobre as redes genéticas que controlam a separação das flores masculinas e femininas, tanto no tempo como no espaço. O principal objetivo desta tese é obter informações sobre os mecanismos moleculares que regulam o ciclo de dormência dos gomos, a indução de flores, e o desenvolvimento de órgãos masculinos e femininos em Q. suber. Sabe-se que a maioria deste tipo de processos são modulados por fatores epigenéticos. Este trabalho proporcionou a primeira caracterização bioinformática de reguladores epigenéticos em Q. suber e, portanto, pode ser utilizado como plataforma para estudos futuros que abordem o seu envolvimento nesta espécie. A regulação epigenética das transições crescimento-dormência, durante o desenvolvimento dos gomos em Q. suber, foi avaliada através do estudo da expressão de reguladores epigenéticos, e pelos padrões epigenéticos avaliados por imunolocalização. Estes resultados destacam que o ciclo de dormência está sob controlo epigenético. A expressão dos homólogos de genes reguladores de dormência identificados em Q. suber foi analisada por qRT-PCR. Os resultados sugerem que os genes QsSHORT VEGETATIVE PHASE-like (QsSVP-like) foram os candidatos mais prováveis a estarem envolvidos no controlo da dormência dos gomos. Bibliotecas de cDNA de estádios iniciais e tardios do desenvolvimento de flores masculinas e femininas, previamente geradas, foram mapeadas contra o genoma de referência de Q. suber, e a expressão diferencial foi re-avaliada através de uma análise mais precisa. Outros transcriptomas disponíveis de Q. suber (gomos, bolotas, embriões, cortiça e raízes) foram analisados para selecionar genes com expressão especificamente masculina ou feminina. Adicionalmente, os níveis de expressão de homólogos de reguladores de floração foram medidos por qRT-PCR em folhas e gomos. Os resultados sugerem que a indução de flores masculinas é separada temporalmente da indução de flores femininas, e que a determinação da identidade dos órgãos sexuais em flores masculinas ou femininas pode ocorrer pela expressão incorreta do gene de classe B QsPISTILLATA (QsPI). Neste trabalho, a regulação de QsPI foi avaliada através da análise de fragmentos do seu promotor, usando a técnica de yeast one-hybrid. Em suma, o conjunto de resultados obtidos nesta tese ajudou a decifrar as redes genéticas e epigenéticas envolvidas no ciclo dormência dos gomos e no desenvolvimento de flores unisexuais em Q. suber, e poderá complementar estudos futuros em outras árvores com caracteristicas semelhantes.The notoriety of Quercus suber in Portugal is strengthened, not only by its economic importance as a cork producer but also as an acorn producer for animal feed. Despite this economic significance, little is known about the molecular mechanisms involved in the establishment and release of dormancy that mediate the annual growth of the plant, or the genetic networks that control the temporal and spatial separation of the male and female flowers. Therefore, the main aim of this thesis is to gain insight about the molecular mechanisms driving bud dormancy cycle, flower induction and male and female flower organ development in Q. suber. Most of these processes are known to be modulated by epigenetic factors. In this study, we provided the first bioinformatic characterization of the complete set of epigenetic regulators found in Q. suber and, thus, can be used as a platform for future studies addressing their involvement in this species. The epigenetic regulation of growth-dormancy transitions during bud development in Q. suber was assessed by studying the expression of epigenetic regulators and the epigenetic patterns evaluated by immunolocalization. The results highlight that the dormancy cycle is under epigenetic control. The homologs of genes known to regulate bud dormancy were identified in Q. suber, and their expression was analyzed by qRT-PCR. The results suggest that QsSHORT VEGETATIVE PHASE- like (QsSVP-like) genes were the strongest candidates to be involved in the maintenance of bud dormancy. Non-normalized cDNA libraries of early and late stages of male and female flower development, previously generated using 454 pyrosequencing technology, were mapped against the Q. suber genome, and the differential expression between male and female flower stages was re-analyzed in order to perform a more accurate analysis. The presence of differential expressed genes between male and female flowers were then analyzed in other available Q. suber transcriptome libraries (buds, acorns, embryos, cork and roots) to select genes with male- or female- specific expression. In addition, the temporal expression levels of Q. suber homologs to the flowering regulators were measured by qRT-PCR in leaves and buds and the results suggest that induction of the unisexual flowers is temporally separated and that the determination of male and female flower organ identity may occur by the misexpression of QsPISTILLATA (QsPI). The potential upstream regulation of QsPI expression was then evaluated by promoter-fragment analysis on a yeast one-hybrid system. In general, the set of results obtained in this thesis helped to decipher the genetic and epigenetic networks involved in bud dormancy dynamics and in unisexual flower development in Q. suber, and may complement future studies in other trees with similar developmental behaviors.This work was funded by FEDER funds through the Operational Competitiveness Programme-COMPETE and by National Funds through FCT—Fundacao para a Ciencia e a Tecnologia under the projects PTDC/AGR-GPL/118508/2010, "Characterization of Reproductive Development of Quercus subet and PTDC/AGR-FOR/3356/2014, "Characterization of cork formation and reproductive biology in a cork oak hybrids population" and the PhD grant ref. SFRH/BD/111529/2015. Work supported by UID/MULTI/04046/2013 and UID/AGR/04129/2013 centre grant from FCT, Portugal (to BiolSl and LEAF, respectively)