Enzymatische polymerisatie van nucleotiden met behulp van alternatieve trifosfaat bouwstenen

De polymerisatie van nucleotiden tot nucleïnezuur wordt gekatalyseerd door polymerasen en dit proces is essentieel voor de overleving en reproductie van alle levende organismen. De laatste decennia werden tal van synthetische analogen van nucleoside-trifosfaten getest als substraat voor verschillende polymerasen met als doel het polymerisatiemechanisme te bestuderen. Chemische synthesemethoden maken het ons mogelijk om elk gedeelte van een nucleoside trifosfaat te modificeren en zo kan het pyrofosfaatgedeelte van een nucleoside trifosfaat vervangen worden door een andere uittredende groep. Een dergelijke studie kan ons veel leren over het mechanisme van enzymatische DNA synthese. Daarnaast kan deze technologie ook toegepast worden voor de ontwikkeling van een nieuw type van antivirale middelen of voor nucleïnezuursynthese. Tenslotte zijn zulke gemodificeerde nucleotiden ook geschikt om nieuwe genetische systemen te ontwikkelen die orthogonaal zijn aan het natuurlijke cellulaire systeem en er dus niet mee kunnen interfereren.In het eerste experimentele hoofdstuk worden verschillende chemische groepen onderzocht als ‘mimics’ voor pyrofosfaat in de polymerisatie van dAMP tot DNA door HIV-1 reverse transcriptase (RT). Diverse alifatische of aromatische groepen die één of twee carbonzuurfuncties dragen, kunnen pyrofosfaat vervangen in het nucleïnezuursyntheseproces, ook al is de efficiëntie lager dan bij het gebruik van natuurlijke trifosfaten. Het inbouwen van nucleotiden lijkt minder efficiënt te verlopen met een fosforamidaatanaloog dan met zijn fosfodiëstertegenhanger. Structuren met slechts één carbonzuurfunctie werken enkel als pyrofosfaat-‘mimics’ als de binding die doorbroken wordt tijdens de polymerisatie een fosfodiëster is.In het tweede experimentele hoofdstuk wordt de invloed van de aard van de binding tussen de uittredende groep en het nucleotide verder onderzocht. Het vervangen van een fosforamidaatbinding door een fosfodiësterbinding vertaalt zich in een efficiëntere inbouw van het nucleotide in DNA. De synthese van langere DNA-ketens waarbij gebruik gemaakt wordt van deze gemodificeerde uittredende groepen wordt echter moeilijk. Een interessante waarneming is dat de ketenverlenging niet afhankelijk is van de aard van de binding tussen de fosfaatgroep en de uittredende groep.Het derde experimentele hoofdstuk beschrijft de synthese en eigenschappen van een nieuwe uittredende groep, het iminodiazijnzuur (IDA). IDA-deoxyadenosine-monofosfaat is een beter substraat voor de enzymatische synthese van DNA (verlenging van DNA-primers met één of meerdere nucleotiden) dan de vroegere onderzochte analogen. De reden voor de vroegtijdige onderbreking van DNA-synthese werd verder onderzocht. Computermodelling van de binding van IDA-dAMP in de actieve plaats van HIV-1 RT lijkt de hypothese te ondersteunen dat IDA-dAMP zich aan het enzym bindt op een gelijkaardige manier als het natuurlijke substraat. Daarna werd de metabole toegankelijkheid van deze alternatieve DNA-bouwsteen bestudeerd. We hebben aanwijzigingen dat natuurlijk voorkomend cyclisch trifosfaat een belangrijke rol kan spelen in zijn biosynthese. Een verdere stap in het onderzoek is de gestuurde evolutie van polymerasen die efficiënt en exclusief IDA-dNMPs als substraat kunnen gebruiken.De metabole toegankelijkheid van IDA-dNMPs werd verder onderzocht in het experimentele hoofdstuk vier. Hierbij werd IDA-gesubstitueerde adenosine-trifosfaat chemisch gesynthetiseerd. Het vermogen van een eoxycytidine kinase van menselijke oorsprong om IDA-ATP als fosfaatbron te gebruiken werd onderzocht. Helaas kan dit deoxycytidine-kinase de overdracht van IDA-monofosfaat naar hun natuurlijke substraten (dA of dC) niet katalyseren. Verder onderzoek dient uit te maken of bacteriële (of gemodificeerde) enzymen een bredere substraatspecificiteit hebben. Uiteindelijk werd ook één bacterieel enzym geïdentificeerd dat wel in staat bleek de afbraak van IDA te katalyseren waardoor het polymerisatieproces irreversibel wordt.We kunnen besluiten dat het pyrofosfaatgedeelte van nucleoside-trifosfaten kan vervangen worden door verschillende andere uittredende groepen tijdens het enzymatisch syntheseproces van DNA. De efficiëntie van deze synthese is afhankelijk van de structuur en van de aard van de binding tussen de uittredende groep en het nucleotide dat in het DNA wordt ingebouwd. Dit onderzoek is slechts een begin en nog vele functionele enzymstudies zijn nodig om dit proces van herkenning en verwerking bij polymerasen te begrijpen. Gestuurde evolutie van polymerasen is nodig om enzymen te ontwikkelen die op een efficiënte manier uitsluitend IDA-deoxynucleoside-monofosfaten kunnen gebruiken als substraten.status: publishe