Study of the NHE6/RACK1 interaction : design of a peptidic inhibitor directed towards prevention of hypoxia-induced chemoresistance

Les cellules tumorales exposées à l’hypoxie sont connues pour développer une résistance accrue aux traitements de chimiothérapie. Ce phénomène est attribué à plusieurs facteurs. Tout d’abord, peu de drogue en circulation atteignent les régions hypoxiques tumorales mal perfusées. Le métabolisme des cellules tumorales en hypoxie est altéré de façon à créer un milieu extracellulaire sur-acidifié qui nuit à la perméabilité membranaire de certaines drogues. Des mécanismes cellulaires tels que l’arrêt du cycle cellulaire, l’inhibition de l’apoptose et l’expression de pompes à efflux s’additionnent aux facteurs tissulaires de résistance. En 1996, il fut observé que des cellules MCF7 résistantes à la doxorubicine possédaient des compartiments intra-vésiculaires plus acides que leurs homologues sensibles à la doxorubicine. Selon le modèle de protonation, séquestration et sécrétion (PSS), proposé pour expliquer cette découverte, les drogues qui agissent à titre de bases faibles peuvent être séquestrées dans des compartiments acides suite à leur protonation et être sécrétées par la suite. Nos résultats ont démontré que la culture en hypoxie mène à une acidification des compartiments intra-vésiculaires accompagnée d’une augmentation de la résistance aux traitements d’agents chimiothérapeutiques de type anthracycline dans des lignées cellulaires de divers types de cancer. L’imagerie confocale nous a permis d’observer une localisation extranucléaire de la doxorubicine qui co-localise de façon partielle avec un marqueur endosomal, la transferrine. Cette étude cherchait d’abord à évaluer l’implication de l’échangeur endosomal NHE6 dans l’acidification intravésiculaire produite par l’hypoxie. De plus, le projet visait à concevoir une stratégie pour contrer cette acidification et améliorer la réponse aux anthracyclines. Les résultats obtenus démontrent que l’hypoxie affecte la localisation de NHE6 ce qui contribue à l’acidification intravésiculaire des endosomes. Le changement de localisation de NHE6 s’effectue suite à une interaction directe et transitoire avec la protéine d’échafaudage RACK1. L’expression d’un peptide de compétition dérivé d’une séquence de 62 aa de NHE6, nous permet de contrer la délocalisation de l’échangeur, de réduire l’ampleur de l’acidification intravésiculaire et d’atténuer la résistance aux anthracyclines causés par l’hypoxie. Une analyse in-silico reposant sur la conservation de résidus fonctionnels, les propriétés biochimiques des interfaces d’interaction protéine-protéine transitoires, ainsi qu’un protocole de raffinement d’arrimage moléculaire, a permis de mettre en lumière une courte portion de la région d’interaction susceptible de permettre l’ancrage de NHE6 à travers une cavité à la surface de RACK1. Abstract : Tumor cells exposed to hypoxia are known to develop resistance to chemotherapy. Several components have been shown to contribute to such resistance. Previous studies indicate that only a small amount of the drug in circulation is able to penetrate poorly perfused hypoxic areas of tumors. Hypoxia alters the metabolism of tumor cells and leads to acidosis of the extracellular fluid thus altering the ability of various drugs to cross lipid bilayers. Compounded with resistance factors observed in living tissues are cellular mechanisms such as cell cycle arrest, inhibition of apoptosis and the expression of drug efflux pumps. In 1996, it was observed that doxorubicin resistant MCF7 cells have more acidic intra-vesicular compartments than their doxorubicin sensitive counterparts. According to the protonation, sequestration and secretion (PSS) model, which was proposed as an explanation for the aforementioned discovery, drugs that act as weak bases can be sequestered in acidic compartments following protonation and eventually be secreted. Our results obtained in several cancer cell lines have shown that the incubation of the cells under hypoxic conditions leads to an acidification of intra-vesicular compartments and an increased resistance to anthracycline. Using confocal imaging we were able to visualize extranuclear doxorubicin spots that partially co-localized with the transferrin endosomal marker. The initial goal of this study was to evaluate the implication of the endosomal Na+/H+ exchanger, NHE6, in intra-vesicular acidification induced by hypoxia. Additionally, the project aimed to elaborate a strategy to counter this acidification and to improve the response to anthracycline drugs. Our results demonstrate that hypoxia affects NHE6 localization which contributes to intra-vesicular acidification. NHE6 change of localization takes place through a direct transient interaction with the scaffold protein RACK1. Expression of a competition peptide derived from a 62 aa sequence of NHE6, was used to block NHE6 delocalization, to reduce the magnitude of intra-vesicular acidification and to attenuate the effect of anthracycline resistance caused by hypoxia. An in-silico analysis based on the conservation scores of functional residues, biochemical properties of transient protein-protein interfaces, as well as a molecular docking refinement protocol, has allowed us to detect a short segment of the region of interaction that may be necessary for NHE6 anchorage on a surface cavity of RACK1