Role of CD163 and other biomarkers of interest in the immunopathogenesis of PRRSV-1 at lung level

El síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS, del inglés Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) es una de las enfermedades víricas más importantes para el sector porcino a nivel mundial debido a las enormes pérdidas económicas que genera. El virus del PRRS (PRRSV, del inglés Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus), agente etiológico del PRRS, juega un papel importante en el complejo respiratorio porcino (PRDC, del inglés Porcine Respiratory Disease Complex) provocando una modulación de la respuesta inmune que favorece su persistencia en el organismo, así como infecciones bacterianas secundarias.La replicación del PRRSV tiene lugar principalmente en el pulmón, siendo los macrófagos alveolares pulmonares (PAMs, del inglés Pulmonary Alveolar Macrophages) la célula diana del virus y el receptor scavenger CD163, el cual se expresa mayoritariamente en los PAMs, esencial para que ocurra una infección productiva. EL PRRSV provoca una neumonía intersticial de moderada a grave, así como una modulación y detrimento de las poblaciones de macrófagos pulmonares, lo que complica este cuadro respiratorio favoreciendo el desarrollo de una bronconeumonía purulenta. Desde el año 2006, se han descrito diferentes brotes asociados a cepas de elevada virulencia del PRRSV-1 a lo largo del continente europeo. Estos brotes presentan un cuadro clínico lesional muy particular caracterizado por una tasa de mortalidad elevada, fi ebre y una sintomatología respiratoria grave asociada con una respuesta inflamatoria más intensa y temprana, así como un marcado daño a nivel pulmonar y de los órganos linfoides. Además, el PRRSV induce una respuesta inflamatoria que varía en función de la cepa del virus y del órgano infectado, por lo que la evaluación in situ de cada uno de los órganos diana del virus es esencial para descifrar la inmunopatogenia de la infección con cepas de diferente virulencia del PRRSV. Teniendo en cuenta estos antecedentes, la presente tesis doctoral se centra en la valoración del cuadro lesional, la evaluación de la muerte celular y la expresión de diferentes marcadores inmunológicos de potencial interés, especialmente el receptor scavenger CD163, a nivel pulmonar, así como la respuesta inmune a nivel sistémico. Por tanto, el principal objetivo de esta tesis consiste en profundizar en la inmunopatogenia de la forma respiratoria del PRRSV-1 con cepas de diferente virulencia durante la fase aguda de la infección. El primer estudio de esta tesis evalúa la expresión, distribución y cinética de células PRRSV-N-protein+, CD163+ y CD107a+ en el pulmón y la tonsila de cerdos infectados experimentalmente con 3 cepas del PRRSV-1: la cepa virulenta del subtipo 3 SU1-bel, y dos cepas de baja virulencia del subtipo 1, LV y 215-06. Los animales fueron eutanasiados a los 3, 7 y 35 días post-inoculación (dpi). La cepa SU1-bel se replicó de forma más eficiente en el pulmón y la tonsila. El número de células CD163+ disminuyó tanto en la tonsila como en el pulmón de todos los animales infectados a los 7 dpi seguido por un incremento al final del estudio, destacando una correlación negativa con la frecuencia de células PRRSV-N-protein+. Además, se observó un incremento en el número de células CD107a+ en todos los grupos infectados a los 35 dpi sin diferencias entre grupos. Mientras que la disminución inicial en el número de células CD163+ parece estar asociada tanto a la replicación del virus como a la activación de procesos de muerte celular, la recuperación de la población de macrófagos CD163+ al final del estudio podría deberse tanto al influjo de células CD163 inmaduras, al reclutamiento de células CD163+ en la zona de infección, o a ambos procesos. Estos resultados sugieren que el hospedador es capaz de restaurar esta subpoblación de macrófagos, así como sus potenciales funciones biológicas después de un mes tras la infección con cepas del PRRSV-1, con una especial relevancia en los animales infectados con la cepa virulenta SU1-bel. En el segundo estudio, nuestro objetivo se centra en comparar los signos clínicos, las lesiones macroscópicas y microscópicas, así como la expresión del receptor CD163 dentro de la subpoblación de PAMs vivos del lavado broncoalveolar (BALF, del inglés BronchoAlveolar Lavage Fluid). Para ello, cerdos convencionales libres de PRRSV se inocularon por vía intranasal con dos cepas del PRRSV-1 de diferente virulencia, la cepa virulenta Lena perteneciente al subtipo 3, o la cepa de baja virulencia 3249, perteneciente al subtipo 1, y que se sacrificaron consecutivamente a los 1, 3, 6, 8 y 13 dpi. Los signos clínicos más graves, así como el mayor grado de lesión a nivel macroscópico y microscópico se observaron en los lechones infectados con la cepa virulenta Lena, en comparación con el grupo 3249. Asimismo, se detectó un descenso temprano en la frecuencia de PAMs en el BALF, asociado a una disminución de la frecuencia y la intensidad de fluorescencia media (MFI, del inglés Median Fluorescence Intensity) del CD163 dentro de estos PAMs que fueron mucho más bajas en los cerdos infectados con Lena que en los cerdos infectados con la cepa 3249. Estos resultados podrían deberse a distintos factores como el efecto de la replicación del PRRSV, la inflamación inducida por el propio virus, la llegada de macrófagos inmaduros para restaurar la homeostasis pulmonar y/o la presencia de células CD163low tras la disminución sufrida por la subpoblación de células CD163+ en el BALF. En el tercer estudio, nos centramos en evaluar los eventos de muerte celular regulada (RCD, del inglés Regulated Cell Death) mediante la expresión de una serie de caspasas tras la infección por ambas cepas del PRRSV-1, Lena y 3249. Las muestras de tejido pulmonar se seleccionaron a partir del experimento anterior. La cepa virulenta Lena indujo una frecuencia signifi cativamente mayor de células TUNEL+ comparado con la frecuencia de las células cCasp3+ durante la primera semana post-infección. Además, ambas cepas de PRRSV-1 activaron la cCasp8 y, en menor medida, la cCasp9 después de la primera semana post-infección junto con un restablecimiento de la frecuencia de macrófagos pulmonares CD163+. Estos resultados evidencian la inducción de diferentes vías de RCD además de la apoptosis, como la necroptosis y la piroptosis, durante la primera semana post-infección, junto con una activación posterior de la vía extrínseca de la apoptosis principalmente durante la segunda semana post-infección. Además, el restablecimiento de los macrófagos CD163+ durante la segunda semana postinfección representa un intento de restaurar las subpoblaciones perdidas de macrófagos pulmonares durante las primeras etapas de la infección. El objetivo del cuarto estudio es explorar el papel de varios marcadores inmunes potencialmente involucrados en la regulación de la respuesta inflamatoria y en la sensibilización del pulmón a infecciones bacterianas secundarias durante la primera semana post-infección con dos cepas del PRRSV-1 de diferente virulencia, Lena y 3249. Para ello se recogieron muestras de suero y tejido pulmonar, que posteriormente fueron procesados para sus correspondientes análisis. Los títulos de viremia y los signos clínicos fueron significativamente más altos en los lechones infectados con la cepa Lena, junto con un aumento en los niveles séricos de IFN-γ e IL-6 en comparación con los cerdos infectados con la cepa 3249. Lena provocó la aparición de las lesiones pulmonares de forma mucho más temprana e intensa, como consecuencia de extensas áreas de consolidación en los lóbulos pulmonares apical y medial, las cuales se correspondieron microscópicamente con focos de bronconeumonía catarro purulenta. La carga viral y la frecuencia de células PRRSV-N-protein+ a nivel pulmonar siempre fueron superiores en los animales infectados con la cepa Lena, que se asociaron a una marcada disminución en la frecuencia de macrófagos CD163+. El número de células CD14+ e iNOS+ aumentó gradualmente durante la infección por PRRSV-1, siendo este incremento mucho más intenso en los cerdos infectados con Lena. La frecuencia de las células CD200R1+ y FoxP3+ alcanzó su pico a los 8 dpi en los animales infectados con ambas cepas del PRRSV-1, observándose además una fuerte correlación entre el número de células CD200R1+ y la lesión pulmonar en los cerdos infectados con Lena. Estos resultados ponen en evidencia el papel que estas moléculas parecen jugar en el desarrollo más temprano de las graves lesiones pulmonares observadas en los animales infectados con la cepa virulenta Lena, sugiriendo la activación de rutas potencialmente involucradas en la restricción de la respuesta inflamatoria a nivel local. Finalmente, nuestro quinto estudio consiste en una aproximación a la histopatología molecular mediante MALDI-MS Imaging con el objetivo de identificar nuevos péptidos involucrados en la inmunopatogénesis del PRRSV-1 así como diferentes patrones de lesión pulmonar. Los análisis se realizaron en 3 animales de cada grupo seleccionados a los 6 y 8 dpi utilizando como criterios la gravedad de los signos clínicos, el grado de lesión pulmonar a nivel macroscópico y microscópico, así como la carga viral en cerdos infectados con las cepas Lena y 3249, en base a los estudios previos. El estudio MALDI-MS Imaging detectó un perfil de 54 péptidos sobreexpresados diferencialmente, así como las proteínas putativas asociadas al comparar ambos grupos infectados con PRRSV-1 con el grupo control a los 6 y 8 dpi. Algunas de estas potenciales proteínas se han descrito previamente en la infección por PRRSV, como la proteína de choque térmico beta-1, la proteína de choque térmico 72, la proteína de unión a GTP inducida por interferón Mx1, la variante de proteína proapoptótica BAKM, la apolipoproteína A-IV, la anexina A6, matrix metalopeptidasa 9, vimentina, complemento C3, filamina A, anexina IV o la proteína asociada al citoesqueleto 4. Además, otras proteínas potenciales sobreexpresadas como la apolipoproteína AI, la proteína relacionada con ras Rap-1b, la proteína ribosómica L13, L-lactato deshidrogenasa B, la tropomiosina 1 o la histona H4 se identificaron en nuestro estudio, aunque no se habían relacionado previamente con la infección por PRRSV. A partir de las proteínas sobreexpresadas se generó una red de grupos funcionales utilizando las herramientas bioinformáticas Cluego y Cluepedia, la cual mostró, que la mayoría de estas proteínas putativas estuvieron involucradas principalmente en la "regulación de la muerte celular" dentro de la categoría de ontología génica de procesos biológicos, mientras que se agruparon en la "vía principal del splicing de ARNm" y "desgranulación de neutrófilos" dentro de la categoría de reactoma y procesos del sistema inmune.Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is still considered one of the costliest viral diseases impacting on the modern pig industry worldwide. PRRS virus (PRRSV), the causative agent of PRRS, is also a key player in porcine respiratory disease complex (PRDC), modulating the host immune response, leading to persistent infection, and favouring secondary bacterial infections. PRRSV replicates primarily in the lung, being the pulmonary alveolar macrophages (PAMs) the target cell for viral replication and CD163 scavenger receptor the essential mediator for viral internalisation and disassembly. PRRSV induces a mild to severe interstitial pneumonia, with modulation and impairment of pulmonary macrophage subpopulations, which may be complicated to suppurative bronchopneumonia. Since 2006, outbreaks of virulent PRRSV-1 strains have been described across Europe. They were characterised by high mortality rates, fever and severe respiratory disorders associated with an earlier and exacerbated infl ammatory response with a marked tissue injury in the lung and lymphoid organs. Furthermore, PRRSV elicits a distinct immune response depending on both the virulence of the strain and the infected tissue, therefore the evaluation of target organs may pave the way to decipher the immunopathogenesis of PRRSV infection with strain of different virulence. In the light of the above statements, the present PhD dissertation focuses on the assessment of the lesion patterns, cell death phenomena and the expression of several immune markers of potential interest, particularly the scavenger receptor CD163, in the lung of infected animals as well as the systemic immune response. Thus, this thesis aims to dissect the immunopathogenesis of the respiratory disease caused by PRRSV-1 strains of different virulence in the acute phase of infection. The fi rst study of this PhD Thesis aims to compare the expression, distribution and kinetics of PRRSV-N-protein, CD163 and CD107a positive cells in the lung and tonsil from experimentally-infected piglets with three different PRRSV-1 strains: a virulent PRRSV-1 subtype 3 strain (SU1-bel) and two low virulent subtype 1 strains, LV and 215–06. Piglets were sequentially euthanised at 3, 7 and 35 dpi. SU1-bel strain replicated more effi ciently in the lungs and tonsils. The number of CD163⁺ cells decreased in both tissues from all infected groups at 7 dpi, followed by an increase at the end of the study, highlighting a negative correlation with the frequency of PRRSV-N-protein⁺ cells. A signifi cant increase in CD107a+ cells was observed in all infected groups at 35 dpi but no differences were observed among them. Whereas the initial decrease of CD163⁺ cells appears to be associated to virus replication and cell death, the later recovery of the CD163⁺ population may be due to either the induction of CD163 in immature cells, the recruitment of CD163⁺ cells in the area of infection, or both. These results suggest that the host is able to restore its macrophage subpopulations as well as their potential biological functions after one-month post-infection with PRRSV-1 strains, finding the greatest recovery in SU1-bel-infected animals. In the second study, our goal was to compare the clinical signs, gross and microscopic lesions as well as the expression of CD163 within live PAM subset from BALF. Conventional piglets were intranasally inoculated with two PRRSV-1 strains of different virulence, the virulent subtype 3 Lena strain or the low virulent subtype 1 3249 strain and euthanised at 1, 3, 6, 8 and 13 dpi. More severe clinical signs as well as higher macroscopic and microscopic lung scores were observed in Lena-infected piglets compared to 3249-infected pigs. A decreased frequency of PAMs in BALF was detected earlier in Lena group. Besides, the frequency and median fluorescence intensity of CD163 within PAMs were much lower in Lena-infected pigs than in 3249-infected pigs. This outcome may result from the effect of PRRSV replication, PRRSV-induced inflammation, the influx of immature macrophages to restore lung homeostasis and/or the evidence of CD163low cells after CD163+ cells decrease in BALF. In the third study, we focused on evaluating Regulated Cell Death (RCD) events by means of the expression of caspases after Lena and 3249 strains infection. Lung tissue samples from the previous experiment were collected at 1, 3, 6, 8 and 13 dpi and hence, processed for their analysis. Lena virulent strain induced a significantly higher frequency of TUNEL+ cells when comparing with the frequency of cCasp3+ cells during the first week post-infection. In addition, both PRRSV-1 strains triggered cCasp8 and in a lesser extent cCasp9 after one-week post-infection together with a replenishment of CD163+ pulmonary macrophages. These results highlight the induction of several RCD pathways beyond apoptosis, such as necroptosis and pyroptosis, during the first week post-infection followed by activation of, mainly, the extrinsic apoptosis pathway during the second week post-infection. Moreover, the recovery of CD163+ macrophages at second week post-infection represents an attempt to restore pulmonary macrophage subpopulations lost during the early stages of the infection. The goal of the fourth study was to explore the role of several immune markers potentially involved during the fi rst week post-infection in the regulation of the infl ammatory response and sensitisation of lung to secondary bacterial infections upon two PRRSV-1 strains of different virulence, Lena and 3249 strains. Sera and lung tissue samples were collected and accordingly processed for their corresponding analyses. Viraemia titres and clinical signs were higher in Lena-infected piglets with an increase in the sera levels of IFN-γ and IL-6 compared to 3249-infected pigs. Lena strain triggered an earlier and stronger onset of lung lesions due to extensive consolidated areas in the apical and medial lung lobes which corresponded microscopically with foci of suppurative bronchopneumonia. Lung viral load and PRRSV-N-protein+ cells were always higher in Lena-infected animals with PRRSV-N-protein+ cells associated with a marked drop in CD163+ macrophages. The number of CD14+ and iNOS+ cells gradually increased upon PRRSV-1 infection, being more intense in Lena-infected pigs. The frequency of CD200R1+ and FoxP3+ cells peaked in both PRRSV-1 strains at 8 dpi, highlighting a strong correlation among CD200R1+ cells and lung injury in Lena-infected pigs. These results point out the role of molecules involved in the earlier and higher extent of lung lesions in piglets infected with the virulent Lena strain, underlining the activation of routes potentially involved in the restraint of the local infl ammatory response. Finally, the fi fth study consisted in an approach to molecular histopathology by MALDI-MSI with the goal of identifying new peptides involved in PRRSV-1 immunopathogenesis and lung lesion patterns. Analyses were conducted in 3 selected animals per group at 6 and 8 dpi. These time-points were selected according to the detection of marked clinical sings, gross and microscopic lung lesion scores as well as viral load in Lena- and 3249-infected piglets after previous studies. MALDI-MSI study revealed a profi le of 54 differentially overexpressed peptides and their putative associated proteins when comparing both infected PRRSV-1-infected groups with control group at 6 and 8 dpi. Some of these putative proteins have been previously described upon PRRSV infection, such as heat shock protein beta-1, heat shock protein 72, interferon-induced GTP-binding protein Mx1, pro-apoptotic protein BAKM variant, apolipoprotein A-IV, annexin A6, matrix metallopeptidase 9, vimentin, complement C3, fi lamin-A, annexin IV or cytoskeleton-associated protein 4. But also other overexpressed putative proteins, such as apolipoprotein A-I, ras-related protein Rap-1b, ribosomal protein L13, L-lactate dehydrogenase B chain, tropomyosin 1 or histone H4 were also identifi ed in our studies but not previously associated with PRRSV infection. A functionality grouped network of the overexpressed proteins created by Cluego and Cluepedia tools, showed that the majority of these putative proteins were mainly involved in “regulation of cell death” within biological processes, and they were in “mRNA splicing-major pathway” and “neutrophil degranulation” within reactome pathways and immune system processes